Vicadrostat i empagliflozyna: nowe biomarkery miRNA w leczeniu CKD

Przewlekła choroba nerek (CKD) dotyka około 10% dorosłych na świecie i powoduje 1,2 miliona zgonów rocznie. Prognozy są niepokojące – do 2040 roku CKD ma stać się piątą główną przyczyną zgonów globalnie, z jednym z największych prognozowanych wzrostów wśród głównych przyczyn śmiertelności. Mimo dostępności terapii pierwszego rzutu, obejmującej inhibitory konwertazy angiotensyny (ACEI), blokery receptora angiotensyny (ARB) oraz inhibitory kotransportera sodowo-glukozowego 2 (SGLT2i), pełna blokada efektów aldosteronu pozostaje wyzwaniem, a stosowane leki zwiększają ryzyko hiperkaliemii.

Vicadrostat – silny i wysoce selektywny inhibitor syntazy aldosteronu – jest obecnie badany w połączeniu z empagliflozyną (SGLT2i) jako potencjalna opcja terapeutyczna w CKD i niewydolności serca. W badaniu fazy 2 vicadrostat wykazał zależną od dawki redukcję albuminurii przy jednoczesnym stosowaniu inhibitorów układu renina-angiotensyna i empagliflozyny, co sugeruje efekt addytywny. Jednak molekularne mechanizmy tego działania pozostają niewyjaśnione.

W ostatnich latach mikro-RNA (miRNA) zawarte w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych moczu (uEV) zyskały uwagę jako potencjalne biomarkery w chorobach nerek. Te małe, niekodujące cząsteczki RNA regulują ekspresję genów i odgrywają kluczową rolę w progresji CKD, w tym w rozwoju włóknienia kłębuszkowego i śródmiąższowego. Co istotne, miRNA wykazują dużą stabilność w zdegradowanych próbkach RNA, co czyni je atrakcyjnymi kandydatami na biomarkery. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w moczu są wydzielane przez komórki wszystkich segmentów nefronu i zawierają miRNA, których profil ulega zmianie u pacjentów z różnymi chorobami nerek, w tym z cukrzycową chorobą nerek.

Jak zaprojektowano badanie profilu miRNA?

Badanie objęło 435 pacjentów z CKD (z cukrzycą typu 2 lub bez niej), którzy uczestniczyli w randomizowanym, kontrolowanym placebo badaniu fazy 2. Uczestnicy otrzymywali empagliflozynę 10 mg raz dziennie lub placebo przez 8-tygodniowy okres wstępny, przy jednoczesnej inhibicji układu renina-angiotensyna. Następnie byli losowo przydzielani do grup otrzymujących vicadrostat w dawkach 3 mg, 10 mg lub 20 mg raz dziennie albo placebo przez 14 tygodni, po czym następował 4-tygodniowy okres obserwacji.

Głównym punktem końcowym była zmiana wskaźnika albumina-kreatynina w moczu (UACR) w pierwszej porannej próbce moczu. Kluczowym dodatkowym punktem końcowym było osiągnięcie ≥30% redukcji UACR po 14 tygodniach. Z 586 randomizowanych uczestników, 452 ukończyło badanie, a próbki moczu dostępne od 412 pacjentów zostały poddane analizie miRNA.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe moczu (uEV) izolowano z 9 ml próbek moczu metodą wirowania (16 000× g przez 10 min w 4°C). MiRNA ekstrahowano za pomocą zestawu exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit, a biblioteki miRNA przygotowywano z około 1 ng wyjściowego RNA. Sekwencjonowanie małych RNA przeprowadzono na platformie Illumina NovaSeq 6000, uzyskując 10 milionów odczytów na próbkę. Analizowano łącznie 724 miRNA, stosując kryteria różnicowej ekspresji: zmiana ≥1,5-krotna i p ≤ 0,01.

Jakie zmiany w profilu miRNA wywołuje leczenie?

Analiza eksploracyjna ujawniła unikalne profile miRNA dla każdego rodzaju terapii. U pacjentów otrzymujących wysokie dawki vicadrostatu (10 lub 20 mg), którzy osiągnęli ≥30% redukcję UACR, zaobserwowano modulację 9 miRNA: wzrost ekspresji 7 miRNA (miR-3158-5p, miR-4436b-3p, miR-6746-5p, miR-454-3p, miR-6802-5p, miR-200c-3p, miR-1296-5p) oraz spadek 2 miRNA (miR-550a-3-5p i miR-142-5p).

Monoterapia empagliflozyną skutkowała zwiększeniem poziomu miR-141-5p oraz obniżeniem 10 miRNA, w tym miR-6509-5p, miR-148b-3p, miR-192-3p, miR-26a-1-3p, miR-625-5p, miR-378a-5p, miR-145-5p, miR-365a-3p, miR-6826-5p i miR-1287-5p. Terapia skojarzona vicadrostatem i empagliflozyną spowodowała obniżenie ekspresji aż 26 miRNA. Co interesujące, tylko jeden miRNA – miR-192-3p – był wspólny dla monoterapii empagliflozyną i terapii skojarzonej.

Szczególnie istotne jest to, że zmiany w profilu uEV miRNA nie były widoczne u uczestników, którzy nie osiągnęli 30% redukcji UACR, ani u osób otrzymujących placebo lub niskie dawki vicadrostatu (3 mg). Modyfikacje profilu miRNA występowały niezależnie od statusu cukrzycowego pacjentów, a poziomy bazowe miRNA były podobne we wszystkich podgrupach diagnostycznych CKD (cukrzycowa choroba nerek, choroby kłębuszkowe, choroba nadciśnieniowa).

Czy efekt terapii utrzymuje się po zakończeniu leczenia?

Jednym z najbardziej intrygujących odkryć było to, że zmiany w wybranych uEV miRNA mierzono w trzech punktach czasowych: w 6. tygodniu leczenia, na końcu 14-tygodniowej terapii oraz podczas wizyty kontrolnej 4 tygodnie po zakończeniu leczenia. Zmiany w profilu ekspresji uEV nie były jeszcze wyraźne po 6 tygodniach terapii vicadrostatem w wysokich dawkach, ale utrzymywały się przez 4 tygodnie po zakończeniu 14-tygodniowego leczenia.

Ta trwałość efektu sugeruje, że vicadrostat wywiera długotrwały wpływ na mechanizmy patogenetyczne, takie jak włóknienie i stan zapalny w nerkach. Jest to szczególnie istotne klinicznie, ponieważ wskazuje na potencjał modyfikacji przebiegu choroby, a nie tylko objawowego łagodzenia albuminurii.

Jakie mechanizmy molekularne stoją za działaniem terapii?

Analiza wzbogacenia szlaków metabolicznych z przewidywanym targetomem kandydujących miRNA ujawniła, że istotnie wzbogacone są szlaki takie jak sygnalizacja TGF-beta, sygnalizacja hemu i sygnalizacja wapniowa. Te szlaki są kluczowe w patogenezie włóknienia nerkowego i progresji CKD.

Szczególnie interesujące jest działanie miR-192-3p, markera związanego z cukrzycową chorobą nerek, który wykazał 89% czułość i swoistość diagnostyczną. Wszystkie badane terapie – empagliflozyna, vicadrostat i ich połączenie – skutecznie redukowały albuminurię i regulowały miR-192-3p niezależnie od statusu cukrzycowego. Mechanistycznie, miR-192 przyczynia się do choroby nerek przez tworzenie pozytywnej pętli sprzężenia zwrotnego z p53 indukowanej przez TGF-β, supresję Zeb2 i promowanie włóknienia nerkowego.

Terapia skojarzona vicadrostatem i empagliflozyną spowodowała również obniżenie poziomu profibrotycznego miR-194-5p. Mocz pęcherzykowy miR-194-5p był podwyższony ponad 3-krotnie w porównaniu z kontrolami u dzieci z zespołem nerczycowym i korelował ze stopniem białkomoczu. Co istotne, poziomy miR-194-5p zmniejszały się równolegle z redukcją białkomoczu podczas leczenia immunosupresyjnego.

Efekty immunomodulacyjne były również widoczne w profilu uEV miRNA po terapii vicadrostatem z empagliflozyną, oprócz efektów związanych z włóknieniem obserwowanych po samym vicadrostacie. Zaobserwowano obniżenie poziomu onkogennego miRNA-381-3p, który jest podwójnym supresorem apoptozy i nekroptozy indukowanej przez TNF i promuje proliferację komórek raka nerki. Terapia skojarzona zmniejszyła również poziom uEV miR-27a-5p, zaangażowanego w regulację sygnalizacji NF-κB.

Wykorzystując publicznie dostępne dane dotyczące miRNA pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkich warunkowo unieśmiertelnionych podocytów, komórek śródbłonka kłębuszkowego, komórek mezangialnych i komórek kanalików proksymalnych, zidentyfikowano, że miR-142-5p wykazuje znacząco wyższą ekspresję w EV pochodzących z komórek kanalików proksymalnych, komórek mezangialnych i podocytów w porównaniu z komórkami śródbłonka kłębuszkowego. miR-192-5p i miR-194-5p są znacząco wzbogacone w podocytach, a miR-381-3p i miR-199b-3p w komórkach śródbłonka kłębuszkowego, podczas gdy miR-192-3p i miR-27a-5p są ekspresjonowane w różnych typach komórek nerkowych.

Co to oznacza dla przyszłości leczenia CKD?

Badanie to dostarcza dowodów na to, że uEV miRNA reagują na interwencję terapeutyczną w CKD i odzwierciedlają różne potencjały mechanistyczne działania vicadrostatu, empagliflozyny lub ich kombinacji w szerokim zakresie typów komórek nerkowych. Silna i trwała modulacja profili miRNA, szczególnie podczas terapii vicadrostatem z empagliflozyną, podkreśla ich potencjalne wykorzystanie jako biomarkerów aktywności choroby i odpowiedzi na leczenie w CKD.

Tradycyjne biomarkery CKD, takie jak UACR i szacowany współczynnik przesączania kłębuszkowego (eGFR), są powszechnie stosowane w badaniach klinicznych, ale nie są idealne do molekularnego różnicowania między terapiami podczas progresji choroby. Profil uEV miRNA może wypełnić tę lukę, oferując bardziej precyzyjny wgląd w mechanizmy działania leków na poziomie komórkowym i molekularnym.

Warto podkreślić, że zmiany w poziomach ekspresji uEV miRNA po leczeniu vicadrostatem samodzielnie lub w połączeniu z empagliflozyną nie korelowały istotnie z bazowymi wartościami UACR i eGFR. Podobnie, bazowe poziomy uEV miRNA nie wiązały się ze zmianami UACR lub eGFR. To sugeruje, że profile miRNA mogą dostarczać informacji uzupełniających, niezależnych od tradycyjnych parametrów nerkowych.

Jakie są ograniczenia tego badania?

Badanie ma kilka istotnych ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników. Badanie kliniczne przeprowadzono w 204 ośrodkach w 29 krajach. Chociaż pobieranie próbek moczu odbywało się zgodnie ze standaryzowanym protokołem, możliwa jest zmienność w wykonywaniu procedur między ośrodkami. Ponadto, nowatorskie metodologie są wymagane do bezwzględnej kwantyfikacji poziomów uEV miRNA, co obecnie stanowi wyzwanie techniczne.

Chociaż badanie oferuje potencjalne wglądy mechanistyczne w terapie vicadrostatem i empagliflozyną, nowo zidentyfikowane biomarkery nie są przeznaczone do monitorowania odpowiedzi na leczenie bez dalszych badań i walidacji. 8-tygodniowy okres wstępny randomizacji empagliflozyny mógł wpłynąć na uEV miRNA, co stanowi dodatkowe ograniczenie w interpretacji wyników.

Ogólnie, te ograniczenia skutkowały raczej słabą korelacją między zidentyfikowanymi miRNA a UACR (najsilniejsza r² = 0,28 dla miR-192-5p). Niemniej jednak, solidna ekspresja miR-142-5p, miR-192-5p i miR-194-5p, z niskimi 95% przedziałami ufności, oferuje potencjał jako mechanistyczne biomarkery dla przyszłych badań. Wymagana jest dalsza walidacja w większych grupach pacjentów i standaryzacja metod ekstrakcji oraz analizy uEV miRNA.

Czy profil miRNA może zmienić sposób monitorowania leczenia CKD?

To badanie po raz pierwszy wykazuje, że terapia vicadrostatem, zarówno w monoterapii, jak i w połączeniu z empagliflozyną, indukuje unikalne i trwałe zmiany w profilu mikro-RNA pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. Szczególnie istotne jest to, że osiem miRNA koreluje ze zmianami albuminurii podczas terapii skojarzonej, co sugeruje addytywny efekt mechanistyczny obu leków. Modulacja kluczowych miRNA zaangażowanych w włóknienie (miR-192-3p, miR-194-5p) i stan zapalny (miR-381-3p, miR-27a-5p) utrzymuje się przez 4 tygodnie po zakończeniu leczenia, co wskazuje na długotrwały wpływ na patogenezę CKD.

Wyniki te otwierają nową perspektywę w monitorowaniu terapii CKD na poziomie molekularnym. Profile uEV miRNA mogą w przyszłości służyć jako precyzyjne biomarkery aktywności choroby i odpowiedzi na leczenie, uzupełniając tradycyjne parametry takie jak UACR i eGFR. Jednak przed wprowadzeniem do praktyki klinicznej konieczna jest dalsza walidacja tych biomarkerów w większych grupach pacjentów oraz standaryzacja metod ich oznaczania. Dla nefrologów oznacza to potencjalną możliwość bardziej precyzyjnego doboru i monitorowania terapii u pacjentów z CKD o różnej etiologii.