PIK3CA jako kluczowy cel terapeutyczny w leczeniu cukrzycy typu 2

Czy znasz wyzwania i mechanizmy T2DM?

Cukrzyca typu 2 (T2DM) jest chorobą endokrynologiczną i metaboliczną, charakteryzującą się podwyższonym poziomem glukozy we krwi z powodu niewystarczającego wydzielania insuliny lub zwiększonej insulinooporności. Ponad 90% przypadków cukrzycy klasyfikuje się jako T2DM. Badania epidemiologiczne wykazały, że w ciągu ostatnich 30 lat częstość występowania cukrzycy u kobiet wzrosła z 3,5 do 5,0%, a u mężczyzn z 3,9 do 6,0%. Choroba ta różni się w zależności od populacji i położenia geograficznego, przy czym około 80% pacjentów z cukrzycą mieszka obecnie w krajach rozwijających się. Regiony takie jak Bliski Wschód, Afryka Północna i Azja Południowa stały się kluczowymi obszarami występowania cukrzycy. Jako najludniejszy kraj rozwijający się, Chiny również odnotowują coroczny wzrost liczby pacjentów z cukrzycą. W porównaniu z osobami bez cukrzycy, chorzy na cukrzycę mają wyższe ryzyko śmiertelności. Cukrzyca spowodowała znaczne globalne obciążenie ekonomiczne, głównie z powodu powikłań, takich jak retinopatia cukrzycowa, nefropatia cukrzycowa i infekcje. Wraz z wydłużaniem się czasu trwania cukrzycy, wzrasta również częstość występowania powikłań, a długość życia większości pacjentów ulega skróceniu. Ponadto, cukrzyca zwiększa również ryzyko nowotworów, co sprawia, że opieka profilaktyczna dla populacji diabetyków jest szczególnie ważna.

Empagliflozyna, inhibitor kotransportera sodowo-glukozowego 2 (SGLT2), poprawia kontrolę glikemii poprzez zwiększenie wydalania glukozy z moczem i została zatwierdzona przez FDA do leczenia dorosłych z T2DM. Empagliflozyna blokuje reabsorpcję glukozy w kanalikach proksymalnych nerek, działając niezależnie od komórek β trzustki, co czyni ją skuteczną na różnych etapach T2DM. Aktualne badania nad molekularnymi mechanizmami działania empagliflozyny w leczeniu cukrzycy koncentrują się głównie na stanie zapalnym i stresie oksydacyjnym. W badaniach klinicznych wykazano, że empagliflozyna zmniejsza ekspresję IL-6, IL-1β i wysokoczułego CRP. Inne badanie wykazało, że po 24 tygodniach leczenia empagliflozyną, poziomy markerów prozapalnych, takich jak wysokoczuły CRP i mieloperoksydaza, znacznie się zmniejszyły, podczas gdy poziom przeciwzapalnej cytokiny IL-10 znacznie wzrósł, co sugeruje, że empagliflozyna może regulować poziom glukozy we krwi poprzez szlaki zapalne.

Liczne badania wykazały, że odpowiedź immunologiczna jest ściśle związana z rozwojem cukrzycy. Układ odpornościowy obejmuje głównie wrodzony układ odpornościowy i adaptacyjny układ odpornościowy. W zakresie odporności adaptacyjnej stwierdzono, że poziomy przeciwciał w surowicy są prawidłowe u pacjentów z cukrzycą, więc zarówno populacja diabetyków, jak i osób bez cukrzycy reaguje na szczepionki przeciwko pneumokokom. Cukrzyca osłabia układ odpornościowy, zwiększając ryzyko infekcji, a częstość występowania infekcji u pacjentów z cukrzycą stopniowo rośnie. U ludzi i myszy, T2DM zmniejsza liczbę przeciwzapalnych podtypów komórek T, jednocześnie zwiększając liczbę prozapalnych komórek T i makrofagów typu M1. Ta zmiana dalej zakłóca metabolizm poprzez uwalnianie cytokin prozapalnych, ostatecznie prowadząc do dysfunkcji komórek β trzustki i insulinooporności. Dodatkowo, liczne badania sugerują, że komórki odpornościowe mogą być regulowane przez circRNA. Zgłoszono, że circRNA regulują funkcję komórek odpornościowych poprzez modyfikacje epigenetyczne. Wcześniejsze badania wykazały, że circPPM1F może promować apoptozę komórek β trzustki i nasilać uszkodzenia trzustki poprzez aktywację makrofagów M1 do uwalniania czynników prozapalnych in vitro. Inne badanie, wykorzystujące bioinformatykę i eksperymenty in vivo, wykazało, że obniżenie poziomu circRNA PIP5K1A poprawiło poziom glukozy i lipidów we krwi u szczurów z T2DM i hamowało stan zapalny poprzez mediację ekspresji ENO1 za pośrednictwem miR-552-3p. Obecnie zidentyfikowano coraz więcej biomarkerów związanych z rozwojem i progresją cukrzycy, które mogą służyć jako potencjalne cele terapeutyczne dla tej choroby.

Jakie metody i strategie badawcze zostały zastosowane?

Celem tego badania było kompleksowe zrozumienie mechanizmów związanych z odpornością, poprzez które empagliflozyna leczy T2DM, prowadzące do odkrycia nowych biomarkerów i celów terapeutycznych, aby poprawić kliniczne wyniki pacjentów z T2DM.

Dane profilowe ekspresji próbek T2DM pobrano z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO). Wybrano dwa zestawy danych z tego samego miejsca biopsji (GSE29221 i GSE7014). Po usunięciu próbek T1DM z zestawu danych GSE7014, uzyskano 32 pacjentów z T2DM i 18 zdrowych kontroli. Macierze ekspresji z obu zestawów danych poddano transformacji logarytmicznej (log2) i normalizacji, aby zapewnić porównywalność i zmniejszyć błąd techniczny przed analizą. Zestaw danych sekwencjonowania jednokomórkowego GSE221156 zawiera 48 próbek, w tym 17 próbek normalnych, 14 pacjentów z prediabetesem i 17 pacjentów z T2DM. Dodatkowo, 1793 geny związane z odpornością uzyskano z Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort).

QuanTIseq to metoda obliczeniowa, która kwantyfikuje bezwzględne frakcje 10 typów komórek odpornościowych przy użyciu danych RNA-seq na dużą skalę i nowatorskiego podejścia do dekonwolucji. Po odczytaniu danych profilu ekspresji w R, algorytm quanTIseq w pakiecie R “IOBR” został użyty do określenia poziomów infiltrujących komórek odpornościowych.

Najpierw pakiet R “limma” został użyty do przeprowadzenia analizy różnicowej na próbkach normalnych i T2DM w zestawach danych GSE29221 i GSE7014 w celu identyfikacji genów różnicowo wyrażanych (DEG). Progi selekcji ustalono na Fold Change (FC) > 1,2 i p < 0,05. Następnie te DEG przecięto z genami związanymi z odpornością, aby uzyskać geny różnicowo wyrażane związane z odpornością (IRDEG) w T2DM.

Aby zbadać potencjalne mechanizmy molekularne związane z rozwojem i progresją T2DM, pakiety R “clusterProfiler” i “org.Hs.eg.db” zostały użyte do przeprowadzenia analizy wzbogacenia Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) na zidentyfikowanych IRDEG. Analiza wzbogacenia GO obejmowała trzy komponenty: składnik komórkowy (CC), funkcję molekularną (MF) i proces biologiczny (BP).

Aby zbadać interakcje między IRDEG, sieć interakcji białko-białko (PPI) została skonstruowana przy użyciu bazy danych Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes (STRING). Po wprowadzeniu zestawu genów, gatunek ustawiono na człowieka, a minimalny wynik interakcji ustawiono na średnie zaufanie (0,40), z wybranymi wszystkimi źródłami interakcji. Po uzyskaniu sieci interakcji, zaimportowano ją do Cytoscape do dalszej analizy. Wtyczka MCODE została użyta do dalszej klasyfikacji sieci interakcji, z progiem wyniku sieci ustawionym na 2, i wybrano “haircut” w wyborze podzbiorów, aby usunąć węzły z tylko jedną krawędzią. Próg wyniku węzła ustawiono na 0,2, K-score na 2, a maksymalną głębokość na 100. Podsieć z najwyższym wynikiem sieci została następnie wybrana jako kluczowa podsieć. Po wyodrębnieniu kluczowej podsieci, dziesięć genów z najwyższymi wynikami MCODE w podsieci zostało wybranych jako kluczowe IRDEG.

Najpierw uzyskano SMILES empagliflozyny z PubChem, a jej strukturę zaimportowano do SwissTargetPrediction, aby przewidzieć jej cele. Przewidywane cele zostały następnie wprowadzone do bazy danych UniProt, aby pobrać symbole genów dla wszystkich celów. Skonstruowano sieć interakcji między tymi genami docelowymi a kluczowymi IRDEG, a wspólne geny zostały wybrane na podstawie dokładnego dopasowania symboli genów do dokowania molekularnego.

Do analizy dokowania molekularnego, struktura 3D empagliflozyny została pobrana z PubChem, a atomy wodoru zostały dodane przy użyciu oprogramowania AutoDockTools. Określono jej torsje i wiązania obrotowe, a plik pdbqt zapisano do dalszej analizy. Struktura krystaliczna PIK3CA została pobrana z bazy danych PDB. W AutoDockTools, oryginalny ligand i cząsteczki wody zostały usunięte, a atomy wodoru dodane, przy czym struktura również została wyeksportowana jako plik pdbqt. Następnie otwarto pliki pdbqt receptora i liganda, a rozmiar i pozycję pola dokowania ustawiono. Funkcja Docking została użyta do przeprowadzenia półelastycznego dokowania między receptorem a ligandem. Wyniki dokowania wizualizowano za pomocą oprogramowania PyMOL. Energia wiązania mniejsza niż -5,0 kcal/mol była uważana za wskazującą na dobre powinowactwo wiązania między receptorem a ligandem.

Krzywa ROC (Receiver Operating Characteristic) jest ważnym narzędziem do oceny modeli, przy czym obszar pod krzywą (AUC) bliższy 1 wskazuje na lepszą wydajność diagnostyczną. Profile ekspresji kluczowych genów w próbkach normalnych i T2DM zaimportowano do R, a krzywą ROC wygenerowano przy użyciu funkcji “roc” z pakietu “pROC”. Opcję “print.auc” ustawiono na TRUE, aby wyświetlić wartość AUC na otrzymanym wykresie.

Aby przeanalizować potencjalną funkcję kluczowych genów w cukrzycy, profile ekspresji mRNA pacjentów z T2DM zaimportowano do oprogramowania GSEA (v4.2.3). Wybrano zestaw danych adnotacyjnych “h.all.v2023.2.Hs.symbols.gmt”, z liczbą permutacji ustawioną na 1000. Określone geny zostały użyte jako etykiety fenotypu, typ permutacji ustawiono na zestaw genów, a algorytm analizy wzbogacenia wybrano jako ważony. Analiza korelacji Pearsona została użyta do obliczenia korelacji między fenotypem a ekspresją, a wyniki zostały odpowiednio uszeregowane. Ścieżki z p < 0,05 w wynikach uznano za istotne.

W tej sekcji wykorzystano zestaw danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek GSE221156, a analizę sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przeprowadzono przy użyciu platform 10x Genomics i GPL24676 (Illumina NovaSeq 6000). W oprogramowaniu R użyliśmy funkcji IntegrateData w pakiecie “Seurat” do integracji danych jednokomórkowych, a następnie kontrolę jakości opartą na następujących kryteriach: nFeature_RNA > 500, 1000 < nCount_RNA < 20 000 i percent.mt < 5%. Następnie przeprowadzono normalizację danych przy użyciu metody LogNormalize w funkcji NormalizeData, z czynnikiem skalowania ustawionym na 10 000. Następnie przeszukaliśmy wysoce zmienne geny za pomocą funkcji "FindVariableFeatures" w pakiecie "Seurat", wybierając metodę jako "vst" i ustawiając "nfeatures" na 2500. Po dalszym skalowaniu danych ekspresji za pomocą funkcji "ScaleData", przeprowadziliśmy analizę głównych składowych (PCA) poprzez konwersję 2500 wysoce zmiennych genów na 2500 wymiarów za pomocą funkcji "RunPCA". Optymalną liczbę głównych składowych określono za pomocą funkcji JackStraw. Do klastrowania komórek użyliśmy funkcji "FindNeighbors" i "FindClusters", ustawiając "resolution" na 0,8 i "dims" na "1:13", aby pogrupować geny o podobnych wzorcach ekspresji w klastry. Wyniki klastrowania zostały następnie zwizualizowane za pomocą funkcji "RunTSNE". Aby zidentyfikować typ komórki dla każdego klastra, przeprowadziliśmy analizę różnicową w celu znalezienia specyficznych dla klastra genów markerowych. Użyto funkcji "FindAllMarkers", wybierając metodę Wilcox do analizy różnicowej, z "min.pct" ustawionym na 0,1. Aby zapobiec pominięciu słabszych sygnałów, ustawiliśmy "logFC.threshold" na 0,1, a zachowaliśmy tylko istotne wyniki, ustawiając p < 0,05. Funkcja "FeaturePlot" została użyta do wyświetlenia poziomów ekspresji określonych genów w różnych klastrach komórek. Po zidentyfikowaniu genów markerowych dla każdego klastra komórek, najbardziej prawdopodobny typ komórki został wywnioskowany przy użyciu pakietu "SingleR", z HumanPrimaryCellAtlasData jako zestawem referencyjnym. Dokonano tego poprzez obliczenie podobieństwa między genami markerowymi każdego klastra a referencyjnymi genami markerowymi typu komórki. Aby przeanalizować interakcje komórka-komórka, które mogą wpływać na funkcję poprzez pary receptor-ligand, użyliśmy "CellChat" do analizy interakcji. Macierz danych została najpierw przekształcona w obiekt CellChat za pomocą funkcji "createCellChat", a "CellChatDB.human" został użyty jako referencyjna baza danych dla interakcji receptor-ligand. Nadekspresję receptorów, ligandów i ich interakcji zidentyfikowano za pomocą funkcji "identifyOverExpressedGenes" i "identifyOverExpressedInteractions". Sieć interakcji komórkowych została następnie wywnioskowana przy użyciu funkcji "computeCommunProb" i "computeCommunProbPathway".

Mysie monocytarne makrofagi RAW264.7 uzyskano z Shanghai Fuheng Biotechnology Co., Ltd. Hodowano je w medium DMEM o normalnej lub wysokiej zawartości glukozy (uzupełnionym 10% FBS i 1% streptomycyny-penicyliny). Komórki utrzymywano w inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO₂. Po 72 godzinach traktowania wysokim poziomem glukozy, niektóre komórki następnie traktowano 0,3, 0,5 lub 1 µmol/L empagliflozyny do dalszych eksperymentów.

Wysiano 100 µL zawiesiny komórkowej zawierającej 5000 komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Po hodowli przez 72 godziny, jak opisano powyżej, do każdego dołka dodano 100 µL roztworu CCK-8 i inkubowano w ciemności przez 1 godzinę. Absorbancję przy 450 nm zmierzono za pomocą czytnika mikropłytek.

Zawiesinę komórkową (2 mL) wysiano na płytkę 6-dołkową o gęstości 200 000 komórek/dołek i inkubowano przez 72 godziny. DCFH-DA rozcieńczono w medium bez surowicy w stosunku 1:1000. Oryginalne medium hodowlane odrzucono, a do każdego dołka dodano 1 mL rozcieńczonego DCFH-DA, po czym inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 minut. Następnie do każdego dołka dodano 1 mL medium bez surowicy do trzykrotnego płukania i dodano kompletne medium hodowlane. Detekcję ROS przeprowadzono za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

qRT-PCR przeprowadzono w celu pomiaru poziomów ekspresji ITGAV, CD44, CD74, CCL5, PTPRC, IL-6, TNF-α i PIK3CA w komórkach. Najpierw całkowity RNA wyekstrahowano z komórek przy użyciu TRIzol zgodnie z instrukcjami producenta. cDNA zsyntezowano z 1 µg całkowitego RNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji (TaKaRa). Reakcję qRT-PCR ustawiono na płytce 96-dołkowej, przy czym każdy dołek zawierał 10 µL SYBR Green PCR Master Mix, 1 µL cDNA, 1 µL startera forward, 1 µL startera reverse i 7 µL wody wolnej od nukleaz. Warunki cyklu PCR obejmowały początkową denaturację w temperaturze 95°C przez 10 minut, a następnie 40 cykli 95°C przez 15 sekund i 60°C przez 1 minutę. Poziomy ekspresji genów docelowych znormalizowano do ekspresji GAPDH. Dane analizowano przy użyciu metody 2^−ΔΔCt, aby określić względne poziomy ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania. Startery użyte w tym badaniu przedstawiono w Tabeli 1. Każdy eksperyment przeprowadzono w duplikatach, aby zapewnić powtarzalność i dokładność.

Western blotting użyto do wykrywania poziomów ekspresji białek PIK3CA, p-PI3K, PI3K, AKT1, AKT2 i AKT3 w komórkach. Najpierw przygotowano lizaty komórkowe przy użyciu buforu lizującego. Stężenie białka określono metodą BCA. Równe ilości białka (20 µg) rozdzielono za pomocą SDS-PAGE i przeniesiono na membranę PVDF. Membranę blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przeciwciała pierwotne przeciwko PIK3CA (1:1000), p-PI3K (1:500), PI3K (1:1500), AKT1 (1:2000), AKT2 (1:500), AKT3 (1:5000) i GAPDH (1:10000) rozcieńczono w buforze blokującym i inkubowano z membraną przez noc w temperaturze 4°C. Po przemyciu TBST, membranę inkubowano z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP (1:3000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Prążki białkowe wizualizowano przy użyciu systemu detekcji ECL, a intensywność prążków kwantyfikowano przy użyciu oprogramowania Image J.

Wszystkie analizy bioinformatyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania R v4.3.1. Test log-rank został użyty do oceny różnic statystycznych między dwiema grupami. Analizę korelacji przeprowadzono metodą Spearmana. Analizę danych eksperymentalnych przeprowadzono przy użyciu SPSS 24.0, a do tworzenia wykresów użyto GraphPad Prism 8.0. Dane o rozkładzie normalnym lub zbliżonym do normalnego przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Jednoczynnikowa ANOVA została użyta do porównania wielu grup, a test LSD zastosowano do porównań parami w obrębie grup. p < 0,05 uznano za statystycznie istotne.

Czy PIK3CA to klucz do terapii T2DM?

T2DM jest ogólnoustrojową chorobą zapalną. Po pierwsze, przeanalizowaliśmy poziomy 64 typów komórek odpornościowych w zestawach danych GSE29221 i GSE7014, aby ujawnić różnice w infiltracji odpornościowej między pacjentami z T2DM a zdrowymi osobami. W porównaniu z próbkami normalnymi, poziomy infiltracji komórek T pamięci CD4⁺, efektywnych komórek T pamięci CD4⁺ (Tem) i komórek dendrytycznych (DC) były znacznie zmniejszone w próbkach T2DM, podczas gdy makrofagi M1 i regulatorowe komórki T (Tregs) były znacznie podwyższone w próbkach T2DM (Ryc. 1A). Dodatkowo, w zestawie danych GSE7014, centralne komórki T pamięci CD4⁺ (Tcm) i komórki Treg były znacznie podwyższone w próbkach T2DM, podczas gdy poziomy makrofagów M1 i M2 były znacznie zmniejszone (Ryc. 1B). Ponieważ infiltracja komórek odpornościowych i ich funkcja są ściśle związane z wydzielaniem białek związanych z IL, przeanalizowaliśmy również różnice w różnych IL między próbkami T2DM a normalnymi. Jak pokazano na Ryc. 1C-D, ekspresja wielu genów związanych z IL, w tym IL-6, IL-7 i IL-10, okazała się nieprawidłowa w obu zestawach danych.

Aby dalej badać rolę odporności w progresji T2DM, IRDEG między próbkami T2DM a normalnymi zidentyfikowano na podstawie zestawów danych GSE29221 i GSE7014. Po znormalizowaniu, te dwa zestawy danych wykazały znaczne zmniejszenie zakresu zmienności ekspresji w próbkach (Rysunek S1A). Po wstępnym przetworzeniu danych zidentyfikowano DEG między próbkami normalnymi a T2DM. Jak pokazano na Rysunku S1B, w zestawie danych GSE29221 zidentyfikowano 4285 genów o zwiększonej ekspresji i 1116 genów o zmniejszonej ekspresji. W zestawie danych GSE7014 zidentyfikowano 3026 genów o zwiększonej ekspresji i 2470 genów o zmniejszonej ekspresji.

Następnie 1793 geny związane z odpornością przecięto z DEG z GSE29221 i GSE7014, co dało 109 IRDEG (Ryc. 2A). Analiza wzbogacenia GO wskazała, że te IRDEG były głównie zaangażowane w region pozakomórkowy, pęcherzyki i system endomembranowy (Rysunek S1C). Wykazywały różne funkcje molekularne, w tym wiązanie receptora sygnałowego, aktywność transduktora molekularnego i regulator funkcji molekularnej, i były zaangażowane w procesy biologiczne, takie jak odpowiedź na chemikalia, regulacja odpowiedzi na bodźce i odpowiedź na substancje organiczne. Dodatkowo, te IRDEG były związane ze ścieżkami KEGG, takimi jak szlak sygnałowy PI3K-Akt, szlak sygnałowy Jak-STAT i różnicowanie komórek Th17 (Rysunek S1C).

Aby dalej badać interakcje między IRDEG, skonstruowano sieć PPI, składającą się ze 109 węzłów i 1725 krawędzi (Ryc. 2B). W tej sieci CD32 nie wykazywał interakcji z innymi genami. Wtyczka MCODE została następnie użyta do przeszukania głównej podsieci z najwyższym wynikiem. Ta podsieć obejmowała 44 węzły, a dziesięć genów o najwyższych wynikach MCODE to CDK4, AR, LEP, VEGFC, EDN1, WNT5A, TNFRSF14, PIK3CA, BRAF i IFITM1 (Ryc. 2C).

Empagliflozyna jest lekiem przeciwcukrzycowym, który został zatwierdzony przez FDA do leczenia dorosłych z T2DM. W SwissTargetPrediction przewidziano 110 genów docelowych empagliflozyny, a ich sieć PPI pokazano na Ryc. 3A. Po zintegrowaniu tej sieci z kluczowymi IRDEG w T2DM, stwierdzono, że PIK3CA był wspólnym celem zarówno empagliflozyny, jak i T2DM (Ryc. 3B). Dokowanie molekularne dodatkowo potwierdziło, że empagliflozyna może skutecznie wiązać się z PIK3CA, z powinowactwem -5,14 kcal/mol (Ryc. 3C). Te ustalenia sugerują, że PIK3CA może być potencjalnym celem terapeutycznym dla T2DM.

Następnie oceniono wydajność predykcyjną PIK3CA dla T2DM za pomocą krzywych ROC. Wyniki wskazały, że w zestawie danych GSE20221 wartość AUC dla PIK3CA w przewidywaniu T2DM wynosiła 76,515% (Ryc. 4A). W zestawie danych GSE7014 wartość AUC dla PIK3CA osiągnęła 83,000% (Ryc. 4B). Wyniki te wykazały, że PIK3CA wykazuje dobrą wydajność predykcyjną dla T2DM.

Aby zbadać funkcje PIK3CA, przeprowadzono GSEA w oparciu o zestaw danych hallmark. Jak pokazano na Ryc. 5A-D, PIK3CA był głównie wzbogacony w apoptozie, szlaku sygnałowym TGF-β, szlaku sygnałowym PI3K-Akt-mTOR i szlaku sygnałowym IL2-STAT5. Te szlaki sygnałowe były wszystkie związane z odpornością, wskazując, że PIK3CA może być skorelowany z procesem immunoregulacyjnym T2DM.

Aby dalej zbadać specyficzne komórki odpornościowe, w których funkcjonuje PIK3CA, wybraliśmy pięć próbek z zestawu danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek związanych z T2DM GSE221156 do analizy. Po przeprowadzeniu kontroli jakości w celu usunięcia komórek o niskiej jakości, uzyskaliśmy macierz danych zawierającą 13 590 komórek wysokiej jakości (Rysunek S2A-D). Dane ekspresji genów znormalizowano za pomocą funkcji “NormalizeData”, a wysoce zmienne geny między komórkami zidentyfikowano za pomocą funkcji “FindVariableFeatures”. Genami o najwyższej zmienności były REG3A, MMP1, MMP3, IL11, RGS5, MT1G, SST, TPSB2, TPSAB1 i RBP4 (Ryc. 6A). Następnie przeprowadzono redukcję wymiarowości PCA na 2500 wysoce zmiennych genach i wyodrębniono informacje z 20 najlepszych wymiarów. Zidentyfikowaliśmy 13 PC z p < 0,05 do dalszej analizy (Ryc. 6B). Następnie przeprowadziliśmy analizę klastrowania komórek przy użyciu algorytmu t-SNE. Jak pokazano na Ryc. 6C, komórki ostatecznie pogrupowano w 17 klastrów. Aby dalej zidentyfikować typy komórek w każdym klastrze, użyliśmy funkcji "FindAllMarkers" do porównania każdego klastra komórek z innymi, identyfikując znaczące DEG (Ryc. 6D). Ostatecznie geny markerowe dla każdego klastra komórek zostały adnotowane, identyfikując siedem typów komórek, w tym komórki śródbłonka, komórki nabłonkowe, makrofagi, neurony, komórki mięśni gładkich, komórki T i tkankowe komórki macierzyste (Ryc. 6E). Wśród tych komórek skupiliśmy się na komórkach odpornościowych (komórki T i makrofagi). Istniały oczywiste interakcje między makrofagami a komórkami T (Rysunek S3A-B), skłaniając do dalszej analizy par receptor-ligand zaangażowanych w ich interakcje. Jak przedstawiono na Rysunkach S3C-D, komórki T głównie oddziałują z makrofagami poprzez białkową fosfatazę tyrozynową typu C receptora (PTPRC (CD45)), czynnik hamujący migrację makrofagów (MIF), przeciwciało monoklonalne 12E7 (MIC2 (CD99)) i ligand 5 chemokiny z motywem C-C (CCL5). Makrofagi oddziałują z komórkami T poprzez wydzielanie fosforoproteiny 1 (SPP1) i lektyny, wiążącej galaktozyd, rozpuszczalnej, 9 (LGALS9).

Dodatkowo stwierdziliśmy, że PIK3CA jest głównie wyrażany w makrofagach w porównaniu do komórek T (Ryc. 7A-F), ujawniając, że PIK3CA może głównie funkcjonować w makrofagach. Dlatego dalej przeanalizowaliśmy korelację między PIK3CA a parami receptor-ligand na makrofagach. Jak pokazano na Ryc. 8A, w zestawie danych GSE29221, PIK3CA był znacząco pozytywnie skorelowany z receptorem CD44 na makrofagach. W zestawie danych GSE7014, PIK3CA był znacząco pozytywnie skorelowany z ITGAV na makrofagach (Ryc. 8B).

Aby dalej potwierdzić związek PIK3CA z makrofagami w T2DM, skonstruowano model indukowany wysoką glukozą przy użyciu makrofagów RAW264.7. Jak pokazano na Ryc. 9A, żywotność komórek w grupie wysokiej glukozy była znacznie zmniejszona w porównaniu z grupą normalnej glukozy (p < 0,001). Dodatkowo, intensywność zielonej fluorescencji była znacznie zwiększona w grupie wysokiej glukozy (Ryc. 9B), wskazując, że poziomy ROS w grupie wysokiej glukozy były wyraźnie podwyższone. Wyniki te ujawniły pomyślne ustanowienie modelu makrofagów indukowanych wysoką glukozą. Następnie zmierzono poziom ekspresji mRNA PIK3CA, aby zbadać potencjalny wpływ wysokiej glukozy na szlak sygnałowy PI3K. Wyniki pokazały, że ekspresja mRNA PIK3CA była znacznie zwiększona w grupie wysokiej glukozy w porównaniu z grupą normalnej glukozy (p < 0,0001, Ryc. 9C).

Dokowanie molekularne wykazało, że empagliflozyna może skutecznie wiązać się z PIK3CA, więc dalej potwierdzono wpływ empagliflozyny na PIK3CA w makrofagach indukowanych wysoką glukozą. Jak pokazano na Ryc. 10A, żywotność komórek wzrosła w sposób zależny od dawki (p < 0,001) po leczeniu 0,3, 0,5 i 1 µmol/L empagliflozyny w komórkach RAW 264.7 indukowanych wysoką glukozą. W porównaniu z grupą nieleczoną empagliflozyną, intensywność zielonej fluorescencji była znacznie zmniejszona w grupie leczonej empagliflozyną (Ryc. 10B), wskazując, że empagliflozyna zmniejszyła produkcję ROS w komórkach RAW 264.7 indukowanych wysoką glukozą. Co ważniejsze, stwierdziliśmy, że empagliflozyna w sposób zależny od dawki zmniejszała ekspresję mRNA PIK3CA w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,01, Ryc. 10C). Wyniki te dalej wskazują, że empagliflozyna może leczyć T2DM poprzez hamowanie PIK3CA.

PIK3CA jest genem na szlaku sygnałowym PI3K/AKT, a poprzednia analiza GSEA wykazała wzbogacenie szlaku sygnałowego PI3K/AKT. Dlatego skupiliśmy się na szlaku sygnałowym PI3K/AKT, aby dalej badać mechanizm celowania w PIK3CA przez empagliflozynę w leczeniu T2DM. Jak pokazano na Ryc. 11A, empagliflozyna w sposób zależny od dawki zwiększała stosunek p-PI3K/PI3K (p < 0,01), ale nie miała znaczącego wpływu na poziomy białka AKT (AKT1, AKT2, AKT3). Analiza bioinformatyczna ujawniła pary receptor-ligand zaangażowane w interakcję między makrofagami a PIK3CA. Wpływ empagliflozyny na poziomy ekspresji tych czynników immunologicznych (CD44 i ITGAV) dalej potwierdzono in vitro. Empagliflozyna hamowała poziomy ekspresji ITGAV i CD44 w sposób zależny od dawki (p < 0,01, Ryc. 11B) w porównaniu z grupą kontrolną. Ponieważ czynniki zapalne są produkowane przez komórki odpornościowe i odgrywają kluczową rolę w chorobie, dalej zbadano wpływ empagliflozyny na poziomy prozapalnych czynników (IL-6, TNF-α). W porównaniu z grupą kontrolną, empagliflozyna zmniejszała ekspresję IL-6 i TNF-α w sposób zależny od dawki (p < 0,05, Ryc. 11C). Wyniki te sugerują, że empagliflozyna może hamować szlak sygnałowy PI3K/AKT w makrofagach indukowanych wysoką glukozą, tym samym łagodząc stan zapalny w T2DM.

Tradycyjne badania głównie uważały otyłość i czynniki metaboliczne za główne wyzwalacze T2DM, podczas gdy T1DM uważano za spowodowany czynnikami immunologicznymi. Niedawne badania ujawniły, że nieprawidłowości immunologiczne są również powszechne u pacjentów z T2DM. W przeciwieństwie do T1DM, gdzie odpowiedź zapalna jest głównie napędzana przez komórki T, główne komórki odpornościowe zaangażowane w T2DM to makrofagi. Makrofagi można sklasyfikować na podtypy M1 i M2. Makrofagi M1 nasilają stan zapalny poprzez promowanie wydzielania czynników prozapalnych, takich jak TNF-α, IL-12 i iNOS, tym samym upośledzając sygnalizację insuliny i funkcję komórek β trzustki. Zmniejszenie liczby makrofagów M1 może pomóc złagodzić insulinooporność, dalej potwierdzając kluczową rolę makrofagów M1 w patogenezie T2DM. Cucak i wsp. zaobserwowali w mysim modelu cukrzycy, że liczba makrofagów w wysepkach była cztery razy większa niż w grupie kontrolnej, składająca się głównie z prozapalnych makrofagów M1. Z kolei makrofagi M2, które mają właściwości przeciwzapalne, pomagają złagodzić insulinooporność i uszkodzenie komórek β. Nasza analiza infiltracji immunologicznej wykazała znaczne zmniejszenie infiltracji makrofagów M2 u pacjentów z T2DM. Spekulujemy, że w warunkach zapalnych makrofagi M2 mogą migrować do tkanki wysepek i chronić komórki β trzustki poprzez swoją funkcję przeciwzapalną, co skutkuje zmniejszoną liczbą w niektórych obszarach. Te ustalenia sugerują potencjalną ochronną rolę makrofagów M2 w T2DM, dostarczając nowej perspektywy dla leczenia cukrzycy.

Aby dalej badać rolę procesów immunologicznych w T2DM, to badanie przeszukało 109 IRDEG związanych z T2DM na podstawie dwóch zestawów danych GEO. Ponieważ większość białek wywiera swoje funkcje biologiczne poprzez interakcje, skonstruowaliśmy sieć PPI IRDEG i przeszukaliśmy 10 kluczowych genów. Po skonstruowaniu sieci interakcji między tymi kluczowymi IRDEG a celami leku przeciwcukrzycowego empagliflozyny, stwierdziliśmy, że PIK3CA może być bezpośrednio działany przez empagliflozynę i jest również kluczowym IRDEG związanym z T2DM. Następnie użyliśmy dokowania molekularnego do obliczenia energii wiązania między PIK3CA a empagliflozyną, która wynosiła mniej niż -5 kcal/mol, wskazując, że te dwa mogą tworzyć skuteczną konformację. Wyniki te sugerują, że PIK3CA może być jednym z kluczowych celów empagliflozyny w leczeniu T2DM.

PIK3CA jest podjednostką katalityczną kinaz PI3 typu I w szlaku PI3K/AKT/mTOR i jest najczęściej zmutowaną podjednostką PI3K. Odgrywa rolę we wzroście komórek, ruchu, przeżyciu, proliferacji, syntezie białek, autofagii, transkrypcji i angiogenezie. Chandler i wsp. wykazali, że mutacje PIK3CA nasilają progresję choroby poprzez zwiększenie wydzielania IL-6. Badanie wykazało, że mutacje PIK3CA zwiększają sygnalizację PI3K. Inne badanie wykazało, że aktywacja szlaku sygnałowego PI3K może zwiększyć ekspresję cytokin (takich jak VEGF, CCL2 i CXCL1) i PD-L1 oraz zmniejszyć infiltrację komórek T w guzach. W naszym badaniu, analiza wzbogacenia GSEA ujawniła, że PIK3CA był wzbogacony w szlakach związanych z odpornością, takich jak szlaki sygnałowe TGF-β, PI3K/AKT/mTOR i IL2/STAT5. Wcześniejsze badania wskazały, że poziom PIK3CA jest pozytywnie skorelowany z komórkami T CD8⁺ i makrofagami. Podobnie, nasze wyniki sekwencjonowania jednokomórkowego wykazały, że PIK3CA był głównie wyrażany w makrofagach. Dodatkowo, analiza korelacji dalej ujawniła znaczące związki między PIK3CA a parami receptor-ligand na makrofagach i komórkach T, a aktywacja tych receptor-ligandów może promować interakcję między makrofagami a komórkami T, tym samym wpływając na mikrośrodowisko immunologiczne.

Ponadto, to badanie wykorzystało makrofagi RAW264.7 do ustanowienia modelu uszkodzenia indukowanego wysoką glukozą in vitro, aby dalej wyjaśnić związek między PIK3CA a makrofagami w rozwoju T2DM, a także rolę empagliflozyny w tym procesie. Cheng i wsp. stwierdzili, że komórki RSC96 traktowane wysoką glukozą stale wykazywały zmniejszoną żywotność komórek i zwiększoną generację ROS. Podwyższone poziomy ROS zaobserwowano zarówno u pacjentów z T2DM, jak i w modelach zwierzęcych cukrzycy, wskazując na bliski związek z cukrzycą i służąc jako wskaźnik referencyjny dla ustanowienia uszkodzenia wysoką glukozą. W tym badaniu, po leczeniu empagliflozyną, żywotność komórek znacznie wzrosła, a poziomy ROS zmniejszyły się, dowodząc efektów terapeutycznych empagliflozyny na T2DM. Wcześniejsze badania ujawniły immunosupresyjny efekt empagliflozyny u pacjentów z cukrzycą. Na przykład, leczenie empagliflozyną zmniejszyło proliferację komórek T CD4⁺. Stwierdzono w komórkach T, że leczenie empagliflozyną może zmniejszyć aktywność ligandu CCL5; w makrofagach indukowanych lipopolisacharydem, leczenie empagliflozyną zmniejszyło ekspresję mRNA CCL-5. Das i wsp. stwierdzili, że leczenie empagliflozyną znacznie zmniejszyło poziomy IL-6 i TNF-α w komórkach kanalików nerkowych indukowanych wysoką glukozą. W modelach szczurów z cukrzycą, leczenie empagliflozyną również znacznie zmniejszyło ekspresję mRNA i białka IL-6 i TNF-α w nerce. To badanie wykazało, że po leczeniu empagliflozyną, ekspresja mRNA czynników immunologicznych makrofagów (ITGAV, CCL5, CD44) i czynników zapalnych (IL-6 i TNF-α) znacznie się zmniejszyła, sugerując, że empagliflozyna może zmniejszyć uszkodzenie makrofagów indukowane wysoką glukozą i złagodzić odpowiedzi immunologiczne pośredniczone przez wysoką glukozę.

Podsumowanie

Badanie ujawniło istotną rolę odpowiedzi immunologicznej w rozwoju cukrzycy typu 2 (T2DM), ze szczególnym uwzględnieniem funkcji makrofagów i szlaku PIK3CA. Analizy bioinformatyczne wykazały, że PIK3CA jest kluczowym genem immunologicznym w T2DM i potencjalnym celem terapeutycznym dla empagliflozyny. Badania na modelu komórkowym potwierdziły, że empagliflozyna hamuje ekspresję PIK3CA w makrofagach indukowanych wysoką glukozą, zmniejszając stan zapalny poprzez regulację szlaku PI3K/AKT. Wykazano również, że lek ten poprawia żywotność komórek i zmniejsza poziom reaktywnych form tlenu. Empagliflozyna obniża ekspresję czynników immunologicznych (ITGAV, CCL5, CD44) oraz prozapalnych (IL-6, TNF-α) w makrofagach, co sugeruje jej potencjał w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej w T2DM. Odkrycia te dostarczają nowych perspektyw w zrozumieniu mechanizmów działania empagliflozyny i roli układu odpornościowego w patogenezie cukrzycy typu 2.