Molekularne mechanizmy działania empagliflozyny w miażdżycy

Jak empagliflozyna może wpływać na miażdżycę na poziomie molekularnym?

Miażdżyca pozostaje wiodącą przyczyną zgonów na świecie – rocznie zabija około 17,6 miliona osób, mimo dostępności skutecznych terapii obniżających lipidy i leków kardioprotekcyjnych. Nawet przy kontrolowanym poziomie cholesterolu LDL pacjenci z chorobą niedokrwienną serca nadal są narażeni na poważne zdarzenia sercowo-naczyniowe, a ryzyko to ma często podłoże zapalne. Dlatego poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych, które modulowałyby mechanizmy zapalne, stało się kluczowym wyzwaniem współczesnej kardiologii.

Inhibitory SGLT2, takie jak empagliflozyna, początkowo wprowadzone jako leki przeciwcukrzycowe, okazały się posiadać istotne korzyści pozaglikemiczne w kontroli czynników ryzyka sercowo-naczyniowego. Przełomowe badanie EMPA-REG OUTCOME po raz pierwszy wykazało, że empagliflozyna zmniejsza całkowite obciążenie powikłaniami sercowo-naczyniowymi u pacjentów z cukrzycą typu 2 i miażdżycą. Badania przedkliniczne na modelach zwierzęcych potwierdziły działanie przeciwmiażdżycowe empagliflozyny, wskazując na mechanizmy takie jak tłumienie stanu zapalnego, zmniejszenie aktywności współczulnej czy redukcję naciekania makrofagów w blaszkach miażdżycowych. Brakuje jednak kompleksowych analiz genetycznych i molekularnych, które wyjaśniałyby interakcje tego leku w obrębie ludzkiego genomu.

W niniejszym badaniu naukowcy zastosowali farmakologię sieciową (network pharmacology) – podejście integrujące bioinformatykę i cheminformatykę – by zidentyfikować potencjalne geny hub związane z działaniem empagliflozyny w miażdżycy. Przeanalizowano dane z publicznie dostępnych baz danych mikromacierzy DNA (GEO), obejmujących próbki tętnic szyjnych od pacjentów z zaawansowaną i wczesną miażdżycą oraz od osób zdrowych. Dzięki zastosowaniu zaawansowanych metod – analizy sieci interakcji białko-białko (PPI), analiz wzbogacenia genów (GO, KEGG, GSEA, GSVA) oraz oceny naciekania komórek odpornościowych (CIBERSORT, ssGSEA) – udało się stworzyć całościowy obraz molekularnych mechanizmów działania empagliflozyny.

Jakie metody zastosowano w analizie genomu?

Badacze przeanalizowali dane z trzech zestawów mikromacierzy DNA pobranych z bazy GEO: GSE100927, GSE43292 (połączone w zbiór testowy, łącznie 61 przypadków miażdżycy i 44 kontrole) oraz GSE28829 (zbiór walidacyjny, 16 zaawansowanych i 13 wczesnych zmian miażdżycowych). Wszystkie próbki pochodziły z ludzkich tętnic szyjnych. Przed analizą statystyczną usunięto efekty seryjne za pomocą pakietu R „sva”, a normalizację przeprowadzono pakietem „limma”.

Cele molekularne empagliflozyny zidentyfikowano w bazach PubChem, SwissTargetPrediction i DGIdb, uzyskując łącznie 118 potencjalnych celów. Cele związane z miażdżycą pobrano z baz CTD i GeneCards (4014 genów). Przecięcie obu zbiorów dało 76 genów związanych z empagliflozyną (ERGs). Następnie przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji genów między grupą miażdżycową a kontrolną (|logFC| ≥ 0,25, skorygowane p<0,05), identyfikując 3503 różnicowo wyrażane geny (AS-DEGs). Przecięcie AS-DEGs z ERGs dało 33 geny (ERDEGs).

Do budowy sieci interakcji białko-białko (PPI) wykorzystano bazę STRING i oprogramowanie Cytoscape. Za pomocą wtyczki CytoHubba zastosowano pięć algorytmów topologicznych (MCC, MNC, Degree, EPC, Closeness), wybierając 10 najważniejszych genów z każdego algorytmu. Przecięcie wyników tych pięciu algorytmów wyłoniło sześć genów hub: IL1B, EGFR, ERBB2, JAK2, SYK i LGALS3.

Analizy funkcjonalne obejmowały wzbogacenie genów (GO, KEGG), analizę zestawów genów (GSEA) oraz analizę wariancji zestawów genów (GSVA). Dodatkowo skonstruowano sieci regulacyjne miRNA-mRNA, TF-mRNA oraz RBP-mRNA, korzystając z baz miRDB, ChIPBase, hTFtarget i starBase v3.0. Ocenę zdolności diagnostycznej genów hub przeprowadzono za pomocą krzywych ROC, a walidację – w zbiorze GSE28829.

Charakterystykę naciekania komórek odpornościowych przeprowadzono algorytmami CIBERSORT (22 typy komórek immunologicznych) i ssGSEA (28 typów), analizując korelacje między genami hub a podtypami komórek odpornościowych.

Które geny są kluczowe dla działania empagliflozyny?

Analiza różnicowej ekspresji genów w zbiorze testowym wykazała statystycznie istotne różnice w ekspresji wszystkich sześciu genów hub między grupą miażdżycową a kontrolną (p<0,001). IL1B, SYK i LGALS3 były istotnie nadekspresjonowane w miażdżycy, podczas gdy EGFR, ERBB2 i JAK2 wykazywały obniżoną ekspresję. Analiza krzywych ROC potwierdziła, że ekspresja tych genów wykazuje dobrą zdolność diagnostyczną w rozróżnianiu miażdżycy od kontroli – wartości AUC wyniosły odpowiednio: IL1B (0,816), EGFR (0,852), ERBB2 (0,836), JAK2 (0,738), SYK (0,895) i LGALS3 (0,845).

W zbiorze walidacyjnym GSE28829 pięć z sześciu genów hub (IL1B, ERBB2, JAK2, SYK, LGALS3) wykazało statystycznie istotne różnice ekspresji między wczesnymi (EA) a zaawansowanymi (AA) zmianami miażdżycowymi. IL1B, SYK i LGALS3 były wyżej wyrażone w zaawansowanych zmianach, podczas gdy ERBB2 i JAK2 – niżej. Wartości AUC dla tych genów w rozróżnianiu EA od AA wyniosły: IL1B (0,721), ERBB2 (0,736), JAK2 (0,880), SYK (0,933) i LGALS3 (0,971), co potwierdza wysoką dokładność diagnostyczną, szczególnie dla SYK i LGALS3.

Analiza korelacji między genami hub wykazała, że IL1B, SYK i LGALS3 były pozytywnie skorelowane między sobą, ale negatywnie z ERBB2, EGFR i JAK2, które z kolei były pozytywnie skorelowane wzajemnie. Analiza podobieństwa funkcjonalnego (Friends) wskazała, że ERBB2 odgrywa istotną rolę w miażdżycy.

Jakie szlaki biologiczne są modulowane przez empagliflozinę?

Analiza wzbogacenia genów (GO) wykazała, że ERDEGs są głównie zaangażowane w procesy biologiczne związane z regulacją adhezji komórka-komórka leukocytów, aktywacją limfocytów T oraz proliferacją komórek T. Komponenty komórkowe obejmowały ogniska adhezji, tratwy lipidowe i mikrodomeny błonowe, a funkcje molekularne – aktywność kinaz serynowo-treoninowo-tyrozynowych, wiązanie z fosfatydyloinozytolo-3-kinazą oraz wiązanie fosfataz.

Analiza szlaków KEGG wykazała, że ERDEGs są wzbogacone w szlaki takie jak: metabolizm węgla centralnego w nowotworach, szlak sygnałowy NF-kappa B, różnicowanie osteoklastów, COVID-19 oraz oporność na inhibitory kinazy tyrozynowej EGFR. Szlak NF-kappa B odgrywa kluczową rolę w stanach zapalnych i odpowiedzi immunologicznej, co podkreśla znaczenie procesów zapalnych w rozwoju miażdżycy.

GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) wykazała istotne wzbogacenie wszystkich genów w szlakach takich jak: sygnalizacja TGFB1 poprzez NFIC, cele TP53 i TP63, szlak PI3KCI, apoptoza przez CDKN1A poprzez TP53, odpowiedź na HGF vs CSF2RB i IL4, aktywacja MAPK przez FcεRI oraz cele NOTCH1. Te szlaki są kluczowe dla różnych etapów rozwoju miażdżycy – od uszkodzenia komórek śródbłonka, przez proliferację i migrację komórek mięśni gładkich, po rekrutację i aktywację komórek zapalnych.

GSVA (Gene Set Variation Analysis) zidentyfikowała 20 szlaków z istotnymi różnicami między grupą miażdżycową a kontrolną, w tym: miogeneza, odpowiedź na uszkodzenie UV, sygnalizacja TGF-beta, przejście nabłonkowo-mezenchymalne, naprawa DNA, sygnalizacja NOTCH, apoptoza, punkt kontrolny G2M, szlak reaktywnych form tlenu, sygnalizacja TNF-alfa poprzez NF-κB, sygnalizacja IL-2/STAT5, cele E2F, sygnalizacja PI3K/AKT/mTOR, szlak p53, aktywacja dopełniacza, odpowiedź zapalna, sygnalizacja IL-6/JAK/STAT3, odrzucanie przeszczepu oraz odpowiedź na interferon gamma i alfa.

Jak geny hub są regulowane na poziomie molekularnym?

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy regulacyjne genów hub, skonstruowano sieci regulacyjne obejmujące mikroRNA (miRNA), czynniki transkrypcyjne (TF) oraz białka wiążące RNA (RBP). Analiza bazy miRDB zidentyfikowała 40 miRNA potencjalnie regulujących pięć z sześciu genów hub, co wskazuje na złożoną sieć regulacji potranskrypcyjnej.

Integracja danych z ChIPBase i hTFtarget pozwoliła zidentyfikować 29 czynników transkrypcyjnych regulujących ekspresję wszystkich sześciu genów hub. Czynniki transkrypcyjne odgrywają kluczową rolę w kontroli dynamiki i ekspresji genów, co może mieć istotne znaczenie w patogenezie miażdżycy.

Ponadto baza starBase v3.0 ujawniła 44 białka wiążące RNA (RBP) potencjalnie oddziałujące z sześcioma genami hub. RBP są kluczowymi graczami w regulacji potranskrypcyjnej, uczestnicząc w splicingu, dojrzewaniu, transporcie, stabilności, degradacji i translacji RNA. Wszystkie te sieci regulacyjne podkreślają złożoność mechanizmów molekularnych leżących u podstaw działania empagliflozyny w miażdżycy.

Jak empagliflozyna wpływa na układ odpornościowy w miażdżycy?

Analiza naciekania komórek odpornościowych za pomocą algorytmu CIBERSORT wykazała istotne różnice w proporcjach 12 typów komórek immunologicznych między grupą miażdżycową a kontrolną (p<0,05). Dotyczyło to komórek B naiwnych, komórek B pamięci, limfocytów T CD8+, spoczynkowych i aktywowanych limfocytów T CD4+ pamięci, limfocytów T gamma delta, aktywowanych komórek NK, monocytów, makrofagów M0 i M1, spoczynkowych komórek tucznych oraz neutrofili.

Analiza korelacji wykazała silną pozytywną korelację między monocytami a aktywnymi komórkami NK (r=0,47) oraz najsilniejszą negatywną korelację między makrofagami M0 a monocytami (r=–0,64). Co istotne, zidentyfikowano specyficzne korelacje między genami hub a podtypami komórek immunologicznych: ERBB2 był istotnie pozytywnie skorelowany z limfocytami T CD8+ (r=0,58, p<0,05), podczas gdy IL1B wykazywał silną negatywną korelację ze spoczynkowymi komórkami tucznymi (r=–0,61, p<0,05).

Algorytm ssGSEA, oceniający 28 typów komórek immunologicznych, potwierdził charakterystyczne profile naciekania komórek odpornościowych. Analiza korelacji ujawniła najsilniejszą pozytywną korelację między LGALS3 a eozynofilami (r=0,70, p<0,05) oraz najsilniejszą negatywną korelację między JAK2 a komórkami NK CD56dim (r=–0,69, p<0,05). Te wyniki sugerują, że empagliflozyna może modulować odpowiedź immunologiczną w miażdżycy poprzez wpływ na różne podtypy komórek odpornościowych.

Jakie są funkcje biologiczne zidentyfikowanych genów hub?

IL1B koduje interleukine-1β, główny regulator odpowiedzi zapalnej w miażdżycy. Empagliflozyna zmniejsza wydzielanie IL-1β poprzez hamowanie inflammasomu NLRP3 i wpływa na szlak TRAF3IP2/ROS/NLRP3/kaspaza-1. Inhibitory SGLT2 istotnie redukują ekspresję cytokin zapalnych w sercu, w tym IL-1β, co sugeruje zmniejszenie uszkodzenia naczyń mediowanego przez stan zapalny. Działanie przeciwmiażdżycowe jest realizowane poprzez mechanizmy zależne od β-hydroksymaślanu, które hamują aktywację inflammasomu.

SYK jest kluczowym mediatorem zaangażowanym w progresję miażdżycy poprzez szlaki sygnałowe stanu zapalnego. Hamowanie SYK wykazuje istotne działanie przeciwproliferacyjne na komórki mięśni gładkich naczyń, osłabiając proliferację i migrację komórek związaną z rozwojem miażdżycy. SYK pełni rolę kluczowego mediatora stanu zapalnego w procesach miażdżycowych, szczególnie w odpowiedzi zapalnej indukowanej przez PCSK9. Kardioprotektywne efekty empagliflozyny mogą obejmować modulację szlaku SYK, przyczyniając się do zmniejszenia stanu zapalnego naczyń i poprawy stabilności blaszki miażdżycowej.

LGALS3 koduje galektynę-3, wielofunkcyjne białko zaangażowane w progresję miażdżycy poprzez aktywację makrofagów i tworzenie komórek piankowatych. Nadekspresja LGALS3 w zmianach miażdżycowych sugeruje jej udział w kaskadach zapalnych, choć dokładna rola wymaga dalszych badań. Empagliflozyna może modulować ekspresję Gal-3 poprzez szlaki przeciwzapalne.

EGFR, członek rodziny receptorowych kinaz tyrozynowych ErbB, odgrywa kluczową rolę w rozwoju miażdżycy. Delecja EGFR specyficzna dla komórek szpikowych istotnie zmniejsza rozmiar zmian miażdżycowych o 43-54% poprzez zmniejszenie gromadzenia się makrofagów, produkcji TNF-α i IL-6 oraz ograniczenie wychwytu lipidów przez obniżenie ekspresji CD36. ERBB2 (HER2) jest obficie wyrażany w komórkach śródbłonka i komórkach mięśni gładkich naczyń, a podwyższony poziom HER2 w surowicy jest niezależnie związany z obecnością choroby wieńcowej i liczbą zwężonych naczyń. Obniżona ekspresja EGFR i ERBB2 zaobserwowana w analizie sugeruje, że empagliflozyna może hamować proliferację komórek mięśni gładkich naczyń i odpowiedzi zapalne, przyczyniając się do działania przeciwmiażdżycowego.

JAK2 koduje kinazę Janusową 2, kluczową kinazę tyrozynową pośredniczącą w sygnalizacji cytokin poprzez szlak JAK-STAT. Mutacja JAK2V617F wiąże się z 12-krotnie zwiększonym ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych, promując przyspieszoną miażdżycę ze zwiększonym stanem zapalnym, większymi rdzeniami martwiczymi i zaburzoną efferocytozą. Jednakże normalny JAK2 makrofagów jest atheroprotektywny, ponieważ jego niedobór powoduje upośledzony odpływ cholesterolu i przyspieszoną miażdżycę. Szlak JAK2/STAT3 napędza polaryzację makrofagów M1 i aktywację inflammasomu NLRP3. Empagliflozyna obniża aktywność szlaku JAK2/STAT1 w makrofagach, zmniejszając odpowiedzi zapalne, co sugeruje, że działanie kardioprotekcyjne empagliflozyny częściowo obejmuje modulację szlaku JAK2.

Czy empagliflozyna może stać się nowym narzędziem w terapii miażdżycy?

Niniejsze badanie po raz pierwszy kompleksowo integrowało farmakologię sieciową i analizę naciekania komórek odpornościowych w celu wyjaśnienia przeciwmiażdżycowych mechanizmów działania empagliflozyny. Zidentyfikowano sześć kluczowych genów hub – IL1B, EGFR, ERBB2, JAK2, SYK i LGALS3 – oraz ich korelacje z podtypami komórek immunologicznych, co dostarcza molekularnego szkieletu do zrozumienia kardioprotektywnych efektów empagliflozyny. Wyniki te stanowią podstawę dla przyszłych badań walidacyjnych oraz sugerują potencjalne strategie terapeutyczne łączące oddziaływanie na szlaki metaboliczne i zapalne w leczeniu miażdżycy. Należy jednak podkreślić ograniczenia badania – umiarkowane zmiany ekspresji genów, brak bezpośredniej walidacji eksperymentalnej oraz korelacyjny charakter analiz wymagają potwierdzenia w badaniach in vitro, in vivo oraz ostatecznie w badaniach klinicznych.