Empagliflozyna chroni jajniki przed uszkodzeniem cisplatyną

Czy nowoczesne strategie onkologiczne stawiają przed nami wyzwania toksyczności?

Rak pozostaje jedną z głównych przyczyn śmierci na całym świecie. Najnowsze badania wskazują, że w 2024 roku w Stanach Zjednoczonych odnotowano około 611 720 zgonów z powodu nowotworów, a 2 001 140 nowych przypadków zostało zdiagnozowanych. Mimo poprawy skuteczności leczenia nowotworów za pomocą cytostatycznych leków chemioterapeutycznych i obniżenia wskaźnika śmiertelności, leki te mogą powodować różnorodne powikłania.

Problemy z płodnością są udokumentowane u kobiet otrzymujących cytostatyczne leki chemioterapeutyczne od dziesięcioleci. Środki te mogą bezpośrednio wpływać na jajniki, prowadząc do dysfunkcji dojrzewania pęcherzyków. Udokumentowano trwałe zmniejszenie liczby pęcherzyków pierwotnych, których nie można zastąpić w wieku dorosłym, spadek poziomu hormonu anty-Müllerowskiego (AMH) oraz zmiany w histopatologii jajników z obecnością włóknienia i niedokrwienia.

Cisplatyna (cis-diaminadichloroplatyna II) jest środkiem alkilującym i pochodną platyny, stosowaną jako lek chemioterapeutyczny w leczeniu różnych typów guzów litych, w tym raka okrężnicy, płuc, jajnika, jąder, szyjki macicy i piersi. Cytotoksyczność CIS nie jest specyficzna dla komórek nowotworowych, ale wpływa również na komórki prawidłowe, powodując zaburzenia funkcji fizjologicznych różnych układów organizmu.

Jednym z najczęstszych działań niepożądanych CIS jest toksyczność jajników, prowadząca do wyczerpania pęcherzyków pierwotnych. Dokładny mechanizm toksyczności jajników wywołanej przez CIS nie jest jeszcze w pełni poznany. Zaproponowano wiele mechanizmów, a dowody sugerują, że stres oksydacyjny odgrywa ważną rolę w toksyczności jajników wywołanej przez CIS, prowadząc do apoptozy, a ostatecznie do martwicy. Najnowsze badania rzucają światło na rolę stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) w cytotoksyczności CIS. Jednak dokładny mechanizm, w którym CIS aktywuje stres ER, prowadzący do aktywacji kaspaz i apoptozy, nadal nie jest znany.

Czy inhibitory SGLT-2 mogą łagodzić skutki działań niepożądanych chemioterapii?

Inhibitory kotransportera sodowo-glukozowego 2 (SGLT-2) są lekami hipoglikemizującymi, które hamują reabsorpcję glukozy w nerkach, zwiększając tym samym wydalanie glukozy z moczem. Inhibitory SGLT-2 są ostatnio szeroko stosowane w różnych stanach, zarówno jako potencjalnie ochronne, jak i jako leczenie. Inhibitory SGLT-2 wykazują silne właściwości przeciwutleniające. Sugerowane dowody pokazują, że inhibitory SGLT-2 mogą wywierać plejotropowe efekty poprzez różne mechanizmy działania – zmniejszają stres oksydacyjny, apoptozę komórek i aktywują autofagię poprzez różne szlaki.

Zmniejszają one ilość wolnych rodników i zwiększają poziom przeciwutleniaczy, takich jak glutation (GSH), dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), a także zmniejszają stan zapalny i ekspresję różnych markerów zapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworów (TNF-α), interleukina 6 (IL-6), czynnik jądrowy-κB (NF-κB) oraz białko C-reaktywne (CRP).

Zaproponowano również, że empagliflozyna (EMPA), inhibitor SGLT-2, wywiera swoje działanie przeciwutleniające poprzez aktywację szlaku SIRT1/NRF2, regulując transkrypcję kilku białek przeciwutleniających, ostatecznie łagodząc apoptozę komórek.

Stres ER jest innym możliwym mechanizmem, poprzez który EMPA łagodzi stres oksydacyjny i apoptozę komórek, modulując i poprawiając usuwanie nieprawidłowo sfałdowanych białek.

Jak zaprojektowano badanie ochronnej roli EMPA przy toksyczności jajników?

W tym badaniu naszym celem jest zbadanie potencjalnej ochronnej roli EMPA w uszkodzeniu jajników wywołanym przez CIS oraz zbadanie mechanizmów zaangażowanych w taki potencjalny efekt.

W badaniu wykorzystano czterdzieści cztery dorosłe samice szczurów albinosów, podzielone na cztery grupy po 11 szczurów: grupę kontrolną (otrzymującą roztwór soli fizjologicznej przez 17 dni), grupę EMPA (10 mg/kg, doustnie przez 17 dni), grupę CIS (roztwór soli fizjologicznej przez 17 dni plus CIS 7 mg/kg, dootrzewnowo w dniu 14) oraz grupę EMPA+CIS (EMPA 10 mg/kg doustnie przez 17 dni plus CIS 7 mg/kg dootrzewnowo w dniu 14).

Próbki krwi i tkanek zostały pobrane w dniu 17 po znieczuleniu szczurów. Krew pobrano przez nakłucie serca, odwirowano przez 15 minut, a surowicę przechowywano w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Próbki tkanek jajników zostały zebrane, przemyte roztworem soli fizjologicznej i podzielone na dwie części – pierwszą przechowywano w -80°C, a drugą utrwalono w 10% zbuforowanej formalinie do oceny histopatologicznej i immunohistochemicznej.

Analizy biochemiczne obejmowały badanie poziomu malonodialdehydu (MDA), dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), hormonu anty-Müllerowskiego (AMH), czynnika jądrowego erytroidu 2-pokrewnego czynnikowi 2 (Nrf2) oraz białka regulowanego glukozą 78 (GRP78) za pomocą szczurzych zestawów ELISA. Analizę histopatologiczną przeprowadzono po utrwaleniu jajników w 10% zbuforowanej formalinie, odwodnieniu etanolem i zabarwieniu hematoksyliną i eozyną. Ocenę uszkodzeń histopatologicznych jajników przeprowadzono w oparciu o parametry: degeneracja komórek pęcherzykowych, przekrwienie naczyń, krwotok i stan zapalny (0: brak, 1: łagodny, 2: umiarkowany, 3: ciężki).

Ekspresję tkankową kaspazy-9 zbadano za pomocą analizy immunohistochemicznej, stosując standardowe procedury z kontrastowym barwieniem hematoksyliną. Średni procentowy obszar immunobarwienia kaspazy-9 w 5 polach o dużym powiększeniu (400x) analizowano przy użyciu oprogramowania Image J.

Ekspresję SIRT1 (Silent information regulator transcript-1) określono za pomocą RT-qPCR, a względną ekspresję genu obliczono metodą 2-ΔΔCt i znormalizowano do β-aktyny.

Jakie zmiany ujawniono na poziomie molekularnym i histopatologicznym?

Wyniki wykazały, że grupa leczona CIS wykazała znaczne zmniejszenie zawartości AMH o 86% w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy jednoczesne podawanie EMPA z CIS spowodowało znaczny wzrost zawartości AMH o 130% w porównaniu z grupą leczoną samym CIS. Badanie histopatologiczne wykazało, że CIS powoduje rozszerzone i przekrwione naczynia krwionośne wraz z zdegenerowanymi komórkami martwiczymi, krwotok śródmiąższowy w całej tkance i brak normalnej struktury komórkowej. Jednoczesne podawanie EMPA z CIS wykazało wyraźną poprawę struktury histologicznej podobną do grupy kontrolnej i grupy leczonej EMPA.

Immunohistochemia kaspazy-9 wykazała, że grupa kontrolna i grupa leczona EMPA wykazały negatywną lub słabą immunoreakcję dla kaspazy-9 w komórkach ziarnistych, podczas gdy w grupie CIS wykazano silną immunoreakcję w komórkach ziarnistych. Jednoczesne podawanie EMPA z CIS prowadziło do negatywnej reakcji podobnej do grupy kontrolnej. Leczenie CIS wykazało 3534% wzrost powierzchni immunoreaktywnej w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy jednoczesne podawanie z EMPA wykazało 2122% spadek w porównaniu z grupą leczoną CIS.

Grupa leczona CIS wykazała znaczny wzrost zawartości malonodialdehydu (MDA) o 40% w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy jednoczesne podawanie EMPA z CIS spowodowało znaczne zmniejszenie zawartości MDA o 1127% w porównaniu z grupą leczoną CIS. Grupa leczona CIS wykazała znacznie zmniejszoną zawartość SOD o 85% w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy jednoczesne podawanie EMPA znacznie zwiększyło SOD o 130% w porównaniu z grupą leczoną CIS.

W porównaniu z grupą kontrolną, CIS znacząco zmniejszył poziom NRF2 o 94%. Podczas gdy leczenie EMPA wraz z CIS wykazało znaczący wzrost NRF2 o 299% w porównaniu z grupą leczoną samym CIS. Stres ER oceniano poprzez analizę GRP78 – grupa kontrolna wykazała znacznie obniżony poziom GRP78 o 1012% w porównaniu z grupą leczoną CIS, podczas gdy podawanie EMPA z CIS wykazało znaczną redukcję GRP78 o 26,4% w porównaniu z grupą leczoną CIS.

Grupa leczona CIS wykazała znaczny spadek ekspresji SIRT1 w jajnikach o 52% w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy grupa leczona EMPA+CIS wykazała znaczny wzrost ekspresji SIRT1 w jajnikach o 102% w porównaniu z grupą leczoną CIS.

Czy mechanizmy toksyczności jajników otwierają nowe perspektywy diagnostyczne?

Toksyczność jajników wywołana przez CIS została zbadana poprzez jej wpływ na produkcję AMH, co zostało dodatkowo potwierdzone przez badanie histopatologiczne, które wykazało wyraźne krwotoki śródmiąższowe, zdegenerowane pęcherzyki jajnikowe i zaburzoną architekturę histologiczną. AMH jest stale używany jako marker rezerwy pęcherzyków wewnątrz jajnika i wskazuje na liczbę pozostałych pęcherzyków. Jest to wcześniejszy predyktor rezerwy jajników niż inne hormony jajnikowe, jak FSH, co wykazano w poprzednich badaniach.

Wcześniejsze badania wykazały negatywny wpływ CIS na poziom AMH, wskazując na zmniejszenie liczby pęcherzyków pierwotnych z powodu apoptozy pęcherzyków wywołanej przez CIS, a także zmniejszenie liczby pęcherzyków pierwotnych i wtórnych u pacjentów otrzymujących CIS w porównaniu z grupami kontrolnymi.

Kilka badań wykazało również obniżony poziom hormonów płodności podczas leczenia CIS; obniżony poziom AMH wskazuje na słabą płodność, uszkodzenie jajników i pęcherzyków. Może to odzwierciedlać mechanizm sprzężenia zwrotnego z jajników z powodu uszkodzenia i wyczerpania pęcherzyków pierwotnych, co wcześniej wykazano w wynikach histopatologicznych.

Co istotne, wstępne leczenie EMPA wykazało wzrost produkcji AMH i poprawę zmian histopatologicznych, wskazując, że EMPA może chronić przed uszkodzeniem jajników wywołanym przez CIS. Abdelzaher i wsp. wykazali ochronny wpływ EMPA na uszkodzenie jajników wywołane haloperidolem. Według naszej wiedzy, jest to pierwsze badanie badające potencjalny ochronny wpływ EMPA na toksyczność jajników wywołaną przez CIS.

Jak SIRT1 i NRF2 kształtują odporność komórkową na stres oksydacyjny?

Stres oksydacyjny wyłonił się jako kluczowy czynnik mechanizmu toksyczności i niewydolności jajników wywołanej przez CIS, wpływający na produkcję AMH i powodujący wyczerpanie pęcherzyków. Obecne badanie wykazało podobne dowody, że CIS spowodował uszkodzenie jajników poprzez zaburzenie równowagi między utleniaczami a przeciwutleniaczami. CIS wykazał wyraźne zmniejszenie SOD, enzymu przeciwutleniającego, i wyraźne podwyższenie MDA w porównaniu z grupą kontrolną.

Malonylodialdehyd był szeroko stosowany jako marker peroksydacji lipidów i stresu oksydacyjnego. Leczenie CIS w tym badaniu i w poprzednich badaniach wykazało wysoki poziom zawartości MDA z powodu wpływu CIS na peroksydację lipidów w tkance jajnika, co wynika z zaburzenia równowagi między utleniaczami a przeciwutleniaczami podczas leczenia CIS.

Najnowsze badania ujawniają ważną rolę aktywacji szlaku SIRT1/NRF2 jako głównego modulatora szlaków przeciwutleniających, przeciwzapalnych i antyapoptotycznych. Coraz więcej dowodów wskazuje, że SIRT1 może regulować w górę NRF2, który jest czynnikiem transkrypcyjnym znanym z odgrywania prominentnej roli w modulowaniu wielu białek downstream, które regulują stres oksydacyjny i regulują w górę aktywność przeciwutleniaczy, takich jak SOD. Podczas stresu oksydacyjnego NRF2 zostaje zużyty, powodując zakłócenie homeostazy utleniaczy i przeciwutleniaczy. Jest to zgodne z naszym obecnym badaniem, które wykazało, że CIS wyraźnie zmniejszył ekspresję SIRT1 z następczym zmniejszeniem poziomu NRF2 i ostatecznie zmniejszeniem przeciwutleniaczy, co wyjaśnia niski poziom SOD i wzrost MDA w porównaniu z grupą kontrolną. W obecnym badaniu EMPA odwróciła zużycie SIRT1 i NRF2 spowodowane ekspozycją na CIS.

Jak EMPA wpływa na apoptozę i stres komórkowy?

Wykazano, że stres oksydacyjny prowadzi do aktywacji szlaku apoptotycznego i aktywacji kaspaz. Podczas gdy wzrost SIRT1 hamuje apoptozę jajników poprzez aktywację przeciwutleniaczy. Zostało to udowodnione w naszym obecnym badaniu, które wykazało pozytywną immunoreakcję kaspazy 9 w grupie leczonej CIS w porównaniu z grupą kontrolną. Wzrost kaspazy 9 zwykle prowadzi do aktywacji kaspazy 3, która jest ostatnim krokiem do inicjacji kaskady apoptotycznej i śmierci komórki.

Co ciekawe, w naszym badaniu EMPA wykazała wyraźny wzrost aktywności SIRT1, nawet w porównaniu z grupą kontrolną. Wyjaśnia to regulację w górę NRF2; hamowanie stresu oksydacyjnego z następczym wyraźnym spadkiem poziomu MDA i zwiększeniem aktywności przeciwutleniaczy z następczym wzrostem poziomu SOD, ostatecznie łagodzącym proces zapalny i zapobiegającym inicjacji szlaku apoptotycznego, co zostało udowodnione przez obniżony poziom kaspazy-9 wykazany przez barwienie immunohistochemiczne tkanki jajnika.

Najnowsze badania badały potencjalny związek między hamowaniem SIRT1 a aktywacją stresu ER poprzez szlak sygnałowy UPR. Mechanistycznie, gdy ekspresja SIRT1 zmniejsza się w komórce, prowadzi to do dysocjacji sensorów przezbłonowych UPR od białka GRP78, aktywując stres ER prowadzący do degradacji białka, powodując uszkodzenie komórkowe, aktywację kaspaz i ostatecznie apoptozę.

Jest to zgodne z naszym badaniem, gdzie w grupie leczonej CIS obserwowano wysoki poziom GRP78, wskazujący na aktywację stresu ER przez CIS. W konsekwencji, aktywacja stresu oksydacyjnego i stresu ER przez CIS wyjaśnia wysoki poziom kaspazy 9, który zaobserwowano, powodując niewydolność jajników, martwicę i krwotok.

EMPA, inhibitor SGLT2, był szeroko badany w kilku organach jako silny przeciwutleniacz, prowadzący do ochrony komórek przed degradacją i apoptozą poprzez różne szlaki przeciwzapalne. EMPA może zwiększać aktywność SIRT1, prowadząc następnie do wzrostu NRF2 i przeciwutleniaczy, chroniąc przed rozległym stresem oksydacyjnym, zapaleniem i apoptozą.

Zwiększona ekspresja SIRT1 przez EMPA, chociaż doprowadziła do regulacji w dół GRP78, co zmniejszyło dysocjację sensorów przezbłonowych UPR, wskazując na niższą aktywność stresu ER, chroniąc komórkę przed degradacją białka i dalszym uszkodzeniem komórkowym i białkowym.

Podsumowując, EMPA może działać na kilka szlaków; hamowanie stresu oksydacyjnego i stresu ER, prowadząc do silnej ochrony przed uszkodzeniem komórkowym i martwicą jajników wywołanymi przez CIS.

Nasze badanie wykazało, że EMPA ma korzystny efekt ochronny w uszkodzeniu jajników wywołanym przez CIS, poprzez różne mechanizmy, zwiększając przeciwutleniacze poprzez aktywację szlaku SIRT1/NRF2 i zmniejszając stres ER poprzez aktywację szlaku SIRT1/GRP78. Oba szlaki spowodowały zmniejszenie apoptozy, poprawę poziomu AMH oraz pęcherzyków jajnikowych i oocytów.

Podsumowanie

Cisplatyna, powszechnie stosowany lek chemioterapeutyczny w leczeniu guzów litych, wywołuje poważne powikłania w postaci toksyczności jajników, prowadząc do wyczerpania pęcherzyków pierwotnych i zaburzeń płodności u kobiet. Mechanizm tego uszkodzenia obejmuje przede wszystkim stres oksydacyjny oraz stres retikulum endoplazmatycznego, które inicjują kaskadę apoptotyczną w tkance jajnikowej. Badania na modelu zwierzęcym wykazały, że empagliflozyna, inhibitor SGLT-2 znany głównie jako lek hipoglikemizujący, może skutecznie chronić jajniki przed toksycznym działaniem cisplatyny. Mechanizm ochronny empagliflozyny opiera się na aktywacji szlaku SIRT1/NRF2, co prowadzi do zwiększenia produkcji przeciwutleniaczy, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa, oraz redukcji markerów stresu oksydacyjnego, w tym malonodialdehydu. Jednocześnie empagliflozyna zmniejsza stres retikulum endoplazmatycznego poprzez modulację białka GRP78 i hamuje aktywację kaspazy-9, kluczowego enzymu w procesie apoptozy. Wyniki badań histopatologicznych i biochemicznych potwierdziły, że jednoczesne podawanie empagliflozyny z cisplatyną znacząco poprawia strukturę histologiczną jajników, zwiększa poziom hormonu anty-Müllerowskiego oraz chroni pęcherzyki jajnikowe przed degeneracją. Hormon anty-Müllerowski okazał się wczesnym i czułym markerem rezerwy jajnikowej, a jego wzrost w grupie leczonej empagliflozyną wskazuje na zachowanie potencjału reprodukcyjnego. Badanie to jako pierwsze dokumentuje ochronne działanie empagliflozyny wobec toksyczności jajników wywołanej cisplatyną i sugeruje, że inhibitory SGLT-2 mogą stanowić obiecującą strategię w profilaktyce powikłań onkologicznych związanych z chemioterapią, otwierając nowe perspektywy terapeutyczne dla pacjentek onkologicznych w wieku rozrodczym.