Biomarkery molekularne przewidują odpowiedź na empagliflozin po AMI

Empagliflozin modyfikuje ekspresję sirtuin i związanych z nimi mikroRNA u pacjentów po ostrym zawale serca (AMI), a panel czterech biomarkerów – SIRT2, SIRT4, miR-182-5p i miR-302a-3p – przewiduje z wysoką dokładnością, którzy pacjenci nie odniosą korzyści z terapii. Takie wnioski płyną z analizy biomarkerowej badania EMMY, opublikowanej w Cardiovascular Diabetology, która objęła 227 pacjentów z AMI obserwowanych przez 26 tygodni. Inhibitory SGLT2, w tym empagliflozin, mają udokumentowany efekt kardioprotekcyjny, jednak mechanizmy molekularne ich działania – szczególnie rola szlaków sirtuin i modyfikacji epigenetycznych – pozostają słabo poznane w warunkach klinicznych.

Dlaczego sirtuiny i miRNA mają znaczenie w terapii empagliflozininą?

Sirtuiny to rodzina deacetylaz zależnych od NAD+, aktywowanych w warunkach restrykcji kalorycznej i stresu metabolicznego. Działają ochronnie na kardiomiocyty poprzez redukcję stresu oksydacyjnego, zapalenia i włóknienia. SIRT1 jest najlepiej poznaną sirtuiną w kardiologii, jednak badacze coraz częściej zwracają uwagę na role SIRT2, SIRT4 i SIRT6 w patofizjologii niewydolności serca. Inhibitory SGLT2, mimo że nie działają bezpośrednio na sirtuiny, mogą je aktywować pośrednio – przez zmiany w homestazie energetycznej i sygnalizacji metabolicznej.

MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące cząsteczki RNA regulujące ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym. W kontekście AMI kluczowe są miR-182-5p (promuje apoptozę kardiomiocytów) i miR-302a-3p (hamuje mitofagię przez supresję FOXO3, nasilając dysfunkcję mitochondrialną). Ich podwyższone poziomy mogą więc sygnalizować nasilone uszkodzenie mięśnia sercowego i gorsze rokowanie.

Zespół z Medical University of Warsaw i Medical University of Graz przeprowadził analizę biomarkerową w ramach badania EMMY, łącząc bioinformatykę, analizę ekspresji RNA i uczenie maszynowe (SHAP), aby zidentyfikować predyktory odpowiedzi na empagliflozin.

Jak zaprojektowano badanie i jakie metody zastosowano?

Badanie EMMY (EudraCT 2016-004591-22, NCT03087773) to randomizowane, kontrolowane placebo badanie kliniczne oceniające empagliflozin u pacjentów po AMI. Do niniejszej analizy włączono 227 pacjentów z dostępnymi próbkami osocza na początku i po 26 tygodniach (łącznie 454 próbki). Ostatecznie analizę odpowiedzi na lek przeprowadzono u 109 pacjentów otrzymujących empagliflozin.

Pacjentów podzielono według zmiany frakcji wyrzutowej lewej komory (ΔLVEF) między punktem wyjściowym a 26. tygodniem. Punkt odcięcia ustalono na 11% – wartość odpowiadającą trzeciemu kwartylowi rozkładu ΔLVEF w grupie empagliflozin. W konsekwencji 28% pacjentów miało ΔLVEF ≥11% (korzystna odpowiedź), a 72% – ΔLVEF <11% (niekorzystna odpowiedź).

Analiza bioinformatyczna: Wykorzystano bazę danych STRING do rekonstrukcji sieci interakcji SGLT2 (5225 węzłów) oraz top 100 interaktorów sirtuin SIRT1–7. Przewidywanie miRNA przeprowadzono przy użyciu pakietu multiMiR (14 baz danych), wybierając top 20% predykcji. Ranking miRNA i genów dokonano za pomocą algorytmu OneR (pakiet wizbionet). Wyłoniono 6 najlepszych miRNA, z czego miR-34a-5p, miR-27a-3p i miR-302a-3p uplasowały się najwyżej.

Analiza ekspresji RNA: Całkowite RNA izolowano z osocza (Maxwell RSC 48), a ekspresję miRNA i mRNA sirtuin mierzono metodą qPCR (TaqMan). Normalizację przeprowadzono względem spike-in cel-miR-39. Wyniki przedstawiono jako wartości log10.

Analiza statystyczna i uczenie maszynowe: Zastosowano testy Manna-Whitneya, Wilcoxona, analizę ROC z 10-krotną walidacją krzyżową oraz regresję logistyczną wieloczynnikową. Model XGBoost z analizą SHAP posłużył do identyfikacji najważniejszych predyktorów.

Które sirtuiny różnicują odpowiedź na empagliflozin?

Pacjenci z ΔLVEF <11% mieli istotnie wyższe wyjściowe poziomy SIRT2 i SIRT4 w porównaniu z pacjentami z ΔLVEF ≥11% (p<0,001 i p=0,001). Analiza ROC wykazała, że:

• SIRT2: AUC=0,806 (p<0,001) – wysoka wartość predykcyjna niekorzystnej odpowiedzi
• SIRT4: AUC=0,765 (p<0,001) – umiarkowana wartość predykcyjna

W modelu regresji logistycznej wieloczynnikowej (uwzględniającym wiek, płeć, nadciśnienie, BMI, ezetymib) panel wysokich poziomów SIRT2 i SIRT4 okazał się niezależnym predyktorem ΔLVEF <11% (OR=18,7; 95% CI: 5,78–60,49; p<0,0001).

Co ciekawe, po 26 tygodniach terapii empagliflozininą zaobserwowano istotny wzrost SIRT6 w porównaniu z placebo (p<0,001). SIRT6 aktywuje szlak AMPK-FoxO3a, zwiększa obronę antyoksydacyjną i redukuje stres oksydacyjny w kardiomiocytach – co może tłumaczyć część efektu kardioprotekcyjnego empagliflozin. Autorzy nie wykryli istotnych zmian w ekspresji SIRT1, SIRT3, SIRT5 i SIRT7, mimo że literatura wskazuje na ich rolę ochronną w AMI.

„Nasze wyniki sugerują, że SIRT2 i SIRT4 mogą działać jako negatywne regulatory funkcji serca po zawale, a ich podwyższone poziomy wyjściowe identyfikują pacjentów, którzy nie odniosą korzyści z empagliflozin” – piszą autorzy badania.

Jakie miRNA przewidują słabą odpowiedź na lek?

Spośród sześciu analizowanych miRNA dwa wykazały istotną wartość predykcyjną:

• miR-182-5p: wyższy poziom u pacjentów z ΔLVEF <11% (p=0,002), AUC=0,716
• miR-302a-3p: wyższy poziom u pacjentów z ΔLVEF <11% (p<0,001), AUC=0,757

MiR-182-5p nasila uszkodzenie mięśnia sercowego poprzez promowanie apoptozy (zwiększa Bax, Bnip3, kaspazę-3/7; zmniejsza Bcl-2). MiR-302a-3p hamuje mitofagię przez supresję FOXO3, co prowadzi do dysfunkcji mitochondriów, stresu oksydacyjnego i apoptozy kardiomiocytów. Oba mechanizmy mogą tłumaczyć, dlaczego pacjenci z wysokimi poziomami tych miRNA gorzej odpowiadają na empagliflozin.

Po 26 tygodniach terapii empagliflozininą zaobserwowano wzrost miR-34a-5p i miR-214-3p (p=0,001 i p=0,003), jednak nie korelowały one z ΔLVEF. MiR-34a-5p negatywnie reguluje SIRT1, nasilając stres oksydacyjny i apoptozę – jego wzrost może być wtórny do adaptacji metabolicznej.

Jak działa połączony panel biomarkerów?

Autorzy stworzyli panel łączący wysokie wyjściowe poziomy SIRT2, SIRT4, miR-182-5p i miR-302a-3p. W analizie ROC z 10-krotną walidacją krzyżową panel uzyskał AUC=0,890 – znacząco lepiej niż poszczególne biomarkery (AUC 0,716–0,806). Przy punkcie odcięcia 0,8316 czułość wyniosła 81%, a swoistość 90%.

W wieloczynnikowej regresji logistycznej (uwzględniającej wiek, płeć, nadciśnienie, BMI, ezetymib) panel okazał się niezależnym predyktorem ΔLVEF <11% z OR=18,703 (95% CI: 5,78–60,49; p<0,0001). Dodatkowo stosowanie ezetymibu wiązało się z korzystną odpowiedzią (OR=0,138; p=0,009), co może odzwierciedlać lepszą kontrolę lipidową i redukcję ryzyka powikłań sercowo-naczyniowych.

Analiza korelacji Spearmana wykazała słabą do umiarkowanej korelację między ΔLVEF a poziomami biomarkerów (R od -0,386 do -0,536; wszystkie p<0,0001). Test Hosmera-Lemeshowa potwierdził dobrą kalibrację modelu.

Analiza SHAP (SHapley Additive exPlanations): Model XGBoost zidentyfikował panel biomarkerów, SIRT2, miR-302a-3p, SIRT4 i SIRT5 jako najważniejsze predyktory w danych laboratoryjnych. W danych demograficznych kluczowe były LVEF wyjściowa, wiek i nadciśnienie. Analiza SHAP potwierdza, że panel biomarkerów ma silniejszy wpływ na predykcję niż standardowe parametry kliniczne.

Co to oznacza dla praktyki klinicznej?

Inhibitory SGLT2, w tym empagliflozin, mają udokumentowany efekt kardioprotekcyjny u pacjentów z cukrzycą typu 2 i niewydolnością serca. Jednak badanie EMPACT-MI wykazało, że wczesne włączenie empagliflozin po AMI nie zmniejszyło istotnie złożonego punktu końcowego (zgon z każdej przyczyny lub hospitalizacja z powodu niewydolności serca) w porównaniu z placebo. To podkreśla potrzebę identyfikacji podgrup pacjentów, które odniosą korzyść z terapii.

Niniejsze badanie sugeruje, że pacjenci z wysokimi wyjściowymi poziomami SIRT2, SIRT4, miR-182-5p i miR-302a-3p mają 18-krotnie wyższe ryzyko niekorzystnej odpowiedzi na empagliflozin (ΔLVEF <11%). Panel ten może więc służyć do:

• Stratyfikacji ryzyka: identyfikacja pacjentów, którzy nie skorzystają z empagliflozin i mogą wymagać alternatywnej terapii lub intensywniejszego monitorowania
• Personalizacji leczenia: wybór inhibitora SGLT2 (empagliflozin vs. dapagliflozin vs. canagliflozin) lub rozważenie innych strategii (np. inhibitory ARNI, antagoniści receptora mineralokortykoidowego)
• Optymalizacji czasu włączenia: decyzja, kiedy rozpocząć terapię inhibitorem SGLT2 po AMI (wcześnie vs. po stabilizacji klinicznej)

Warto podkreślić, że NT-proBNP – klasyczny marker niewydolności serca – nie różnicował grup z ΔLVEF ≥11% vs. <11% na początku badania, co podkreśla unikalną wartość panelu molekularnego. Dopiero po 26 tygodniach terapii empagliflozininą NT-proBNP uległ obniżeniu, ale nie korelował z ΔLVEF.

Jakie mechanizmy molekularne stoją za działaniem empagliflozin?

Empagliflozin działa wielotorowo, a kluczowe szlaki obejmują:

• Metabolizm energetyczny: Inhibicja SGLT2 w nerkach prowadzi do glikozurii, co indukuje stan „restrykcji kalorycznej” i aktywuje sirtuiny (zwłaszcza SIRT1 i SIRT6). Aktywacja SIRT6 zwiększa ekspresję genów antyoksydacyjnych i poprawia metabolizm mitochondrialny.
• Redukcja stresu oksydacyjnego: SIRT6 aktywuje szlak AMPK-FoxO3a, co zwiększa MnSOD (dysmutaza ponadtlenkowa manganowa) i redukuje ROS (reaktywne formy tlenu). To chroni kardiomiocyty przed uszkodzeniem reperfuzyjnym.
• Hamowanie apoptozy: Obniżenie miR-182-5p i miR-302a-3p pod wpływem empagliflozin może ograniczać apoptozę kardiomiocytów i dysfunkcję mitochondrialną.
• Modulacja zapalenia i włóknienia: Sirtuiny (SIRT1, SIRT3, SIRT6) hamują szlaki NF-κB i zmniejszają wydzielanie cytokin prozapalnych (IL-6, TNF-α).

Jednak u pacjentów z wysokimi poziomami SIRT2 i SIRT4 mechanizmy te mogą być zaburzone. SIRT4 hamuje GDH (dehydrogenaza glutaminianowa), co osłabia metabolizm aminokwasów i zmniejsza dostępność α-ketoglutaranu – kluczowego substratu cyklu Krebsa. SIRT2 może nasilać przerost kardiomiocytów indukowany przez angiotensynę II. Oba te efekty mogą przeciwdziałać korzystnemu działaniu empagliflozin.

„Nasze wyniki sugerują, że aktywacja szlaków SIRT2 i SIRT4 może być szkodliwa w kontekście AMI, a ich wysokie poziomy identyfikują pacjentów z niekorzystnym profilem metabolicznym i przebudowy serca” – konkludują autorzy.

Jakie są ograniczenia badania i kierunki przyszłych badań?

Autorzy wskazują kilka istotnych ograniczeń:

• Brak walidacji białkowej: Analiza objęła tylko mRNA sirtuin, nie potwierdzono poziomów białek (ograniczona objętość osocza, brak walidowanych testów).
• Homogeniczność populacji: Wszyscy pacjenci byli rasy kaukaskiej (rekrutacja w Austrii), co ogranicza możliwość uogólnienia wyników.
• Mała liczba kobiet: Uniemożliwiła analizy zależne od płci.
• Brak walidacji zewnętrznej: Wyniki wymagają potwierdzenia w niezależnej grupie przed wdrożeniem do praktyki klinicznej.
• Brak badań funkcjonalnych: Nie przeprowadzono eksperymentów in vitro/in vivo potwierdzających przyczynową rolę zidentyfikowanych miRNA.
• Niska wykrywalność SIRT6 i SIRT7: 65–67% próbek – co ogranicza ich przydatność jako biomarkerów.
• Brak porównania z innymi inhibitorami SGLT2: Badanie dotyczyło tylko empagliflozin – nie wiadomo, czy pacjenci z niekorzystną odpowiedzią skorzystaliby z dapagliflozin lub canagliflozin.

Przyszłe badania powinny obejmować:

• Walidację panelu biomarkerów w niezależnych grupach międzynarodowych
• Badania porównawcze różnych inhibitorów SGLT2 po AMI
• Analizę proteomiczną i metabolomiczną w celu pełniejszego zrozumienia mechanizmów
• Badania funkcjonalne (in vitro, in vivo) potwierdzające rolę SIRT2, SIRT4, miR-182-5p i miR-302a-3p w patofizjologii AMI
• Ocenę długoterminowych punktów końcowych (MACE, zgon sercowo-naczyniowy)

Jakie wnioski płyną z tego badania?

Badanie EMMY dostarcza pierwszych klinicznych dowodów, że empagliflozin modyfikuje ekspresję sirtuin i miRNA u pacjentów po ostrym zawale serca. Panel czterech biomarkerów – SIRT2, SIRT4, miR-182-5p i miR-302a-3p – przewiduje z wysoką dokładnością (AUC=0,890), którzy pacjenci nie odniosą korzyści z terapii empagliflozininą (ΔLVEF <11%). To odkrycie otwiera drogę do personalizacji leczenia inhibitorami SGLT2 w kardiologii. Kluczowe przesłanie: wysokie wyjściowe poziomy tych biomarkerów sygnalizują nasilone uszkodzenie metaboliczne i przebudowę, które nie są kompensowane przez standardowe działanie empagliflozin. Identyfikacja takich pacjentów pozwoli na wczesną modyfikację terapii – np. intensyfikację leczenia niewydolności serca (inhibitory ARNI, antagoniści receptora mineralokortykoidowego) lub wybór alternatywnego inhibitora SGLT2. Wyniki wymagają potwierdzenia w niezależnych grupach, jednak już teraz sugerują, że charakterystyka genomiczna może stać się standardem w stratyfikacji ryzyka i personalizacji terapii po zawale serca.

Pytania i odpowiedzi